CLOSTRIDI NELLE ACQUE (MPN)

I Clostridi sono microrganismi appartenenti al genere Clostridium della famiglia delle Bacillaceae, anaerobi obbligati, bacilli gram-positivi, sporigeni, riducono il solfito con produzione di solfuri e producono spore termoresistenti. Sono normalmente saprofiti e vivono negli strati superficiali del terreno, in acqua, negli scarichi fognari ed anche nell’intestino di alcuni animali, compreso l’uomo. Il loro numero nelle feci, rispetto ai coliformi e agli streptococchi, è spesso inferiore. Alcune specie producono potenti esotossine (Clostridium tetani e Clostridium botulinum) che causano sindromi particolarmente gravi come il tetano, il botulismo e la gangrena gassosa. Sono privi di citocromi e sono sia catalasi che perossidasi negative; infatti in presenza di acqua ossigenata muoiono per via dell’ossigeno che si libera in quanto incapaci di decomporre la molecola. Se vengono coltivati in anaerobiosi o con scarsa concentrazione di ossigeno, utilizzano le sostanze organiche (zuccheri ed aminoacidi) producendo alcooli, acidi misti e gas come l’anidride carbonica, idrogeno e acido solfidrico con conseguente formazione di odori sgradevoli, fino ad arrivare al fenomeno della putrefazione. Per la loro capacità di produrre forme di resistenza (spore), sono in grado di sopravvivere più a lungo nell’ambiente e di resistere ai trattamenti di depurazione e di disinfezione delle acque.

Per i controlli della qualità delle acque i microrganismi vengono ricercati nella loro forma sporale per valutarne la concentrazione in un certo volume di acqua. La loro presenza può essere indice di inquinamento fecale anche non recente.

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Principio del metodo

Il metodo consente di determinare la concentrazione delle spore dei microrganismi, appartenenti al genere Clostridium, presenti in un volume d’acqua preventivamente trattato al calore per distruggere le forme microbiche vegetative, favorendo contemporaneamente la germinazione delle forme sporali.
Possono essere utilizzate due tecniche analitiche:

• Metodo A: metodo del numero più probabile o dei tubi multipli (MPN). Con questo metodo è possibile determinare la concentrazione delle spore, in campioni di acqua, tramite una stima statistica determinata sulla base della combinazione di tubi positivi e negativi ottenuti inoculando aliquote diverse del campione in terreno colturale. Il risultato può essere ricavato, in base alle diverse combinazioni, dall’apposita tabella già predisposta.
• Metodo B: metodo della filtrazione su membrana (MF). Questo metodo permette di contare il numero delle colonie cresciute su una membrana posta su terreno colturale. Esistono in commercio diversi substrati usati per l’isolamento delle spore di clostridi che garantiscono buoni risultati in fase analitica, anche se non esiste un unico substrato in grado di far crescere tutte le specie presenti.

In questo articolo si tratterà il Metodo A (metodo MPN): Con questo metodo viene determinata la concentrazione delle spore in campioni di acque tramite la formula probabilistica che definisce il numero più probabile necessario a produrre combinazioni di tubi positivi e negativi in repliche di diluizioni decimali. Il metodo è particolarmente adatto per l’esame di acque che presentano un’elevata torbidità.

Interferenze e cause d’errore

E’ indispensabile garantire un ambiente anaerobico durante il periodo d’incubazione ed usare terreni selettivi sfruttando l’azione di miscele di antibiotici specifici.

Conservazione dei campioni

L’analisi dei campioni deve essere svolta immediatamente se possibile, altrimenti si potrà mantenerli a 5°C ± 3 per periodi di 24-48 ore prima dell’esame, senza eccedere nell’attesa.

Volume da analizzare

Per l’analisi è necessario determinare il volume in base alla tipologia e alla qualità dell’acqua da esaminare. Per acque reflue o comunque di bassa qualità generalmente è necessario analizzare diluizioni scalari del campione; mentre per acque già sottoposte a trattamento possono essere analizzate diluizioni minori e comunque aliquote diverse.

Apparecchiatura

Oltre alla normale attrezzatura di base di laboratorio, per lo svolgimento dell’analisi, è necessario avere a disposizione:

• giara per anaerobiosi;
• Autoclave, bagnomaria;
• Pipette sterili da 10ml, 5ml, provette 20×200, beute da 250;
• Bilancia;
• Pompa da vuoto, giara per anaerobi, buste a tenuta;
• Microscopio ottico a trasmissione;
• Incubatore termostatico regolato a 36°C ± 2;
• Phmetro.

Terreni di coltura e reattivi

• Brodo differenziale per clostridi DCRM (Differential Reinforced Clostridial Medium), la cui composizione è la seguente:

Differential Reinforced Clostridial Medium
Ingredienti	gr/litro
Peptidi digeriti di tessuto animale	10,0
Estratto di carne	10,0
Estratto di lievito	1,5
Amido	1,0
Glucosio	1,0
Sodio acetato, idratato	5,0
L-Cisteina cloridrato	0,5
pH finale (a 25°C)	7,2±0,2

• Agar soia triptone (TSA), (questo terreno trova limitato impiego in microbiologia clinica perché alimenta la crescita di vari batteri esigenti), la cui composizione è la seguente:

Triptone (digerito pancreatico di caseina)	15,0g
Soia (digerito papaico di farina di soia)	5,0g
NaCl	5,0g
Agar	15,0g
H2O	1000 ml
pH 7,3±0,2

• Reattivi per la produzione di ambiente anaerobico tipo Anaerocult A (bustine acquistabili pronte all’uso)
• Acqua ossigenata al 3%
• Kit per la colorazione del Gram.

Procedimento

• Pretrattare il campione , immergendo il contenitore con almeno 100 ml di acqua da analizzare in bagnomaria, regolato a 80°C, per 10 minuti. Raffreddare rapidamente in acqua corrente.
• In parallelo preparare la serie di tubi contenenti il DCRM brodo, precedentemente sterilizzato e dispensato nelle provette. Questo terreno presenta una composizione tale da permettere l’accrescimento e la differenziazione dei clostridi solfito riduttori. Infatti la presenza di peptone digerito di tessuti animali, estratto di carne, estratto di lievito, amido, acetato di sodio forniscono sostanze nutritive essenziali per il metabolismo batterico; Il glucosio è il carboidrato fermentabile e serve come fonte di carbonio e di energia, mentre la L–cisteina cloridrato agisce come agente riducente. Il solfito di sodio e il citrato ferrico vengono aggiunti come indicatori. I Clostridi solfito riduttori producono solfuro da solfito, che si traduce nella formazione di un colore nero del medium per la formazione di FeS.
• Le provette 20×200 devono contenere 10ml di brodo a doppia concentrazione; cinque provette per ogni serie (5 serie).
• Preparare anche una beuta da 250ml, con 50ml di brodo a doppia concentrazione.
• Dopo aver raffreddato il campione e i contenitori del terreno di coltura dispensare come segue:
  – 50 ml di campione nella beuta,
  – 10 ml di campione in ciascun tubo della serie da cinque.
• Collocare i tubi nella giara per anaerobi e disporre il sacchetto di Anaerocult A, reidratato con 35ml di acqua, accanto i tubi di coltura, chiudere immediatamente la giara e incubare a 37°C per 48 ore.
• All’esame dello sviluppo sono considerati positivi quei tubi che presentano annerimento completo o parziale.

Le eventuali conferme verranno dalla diagnosi morfologica, sottoponendo le colture ottenute alla colorazione di Gram: bastoncelli gram positivi con spore subterminali di colore blu: In colture vecchie talvolta i bacilli assumono la tinta rossa.

Sottoporre i tubi sospetti a prove di crescita in aerobiosi e anaerobiosi inoculando in agar TSA porzioni prelevate dal brodo differenziale.

 Espressione dei risultati

In genere il numero di microbi piu’ probabile(MPN) viene stimato dalla formula di THOMAS:

\( MPN=frac{numero di tubi positivi}{sqrt{ml cmp tubi negativi X ml cmp tutti i tubi}} \)

In alternativa alla applicazione della formula si ricorre all’uso delle tabelle di probabilità come quella di seguito riportata:

 

ml di acqua per beuta ed ogni tubo		MPN per 100ml	Limiti fiduciali al 95%
Numero dei tubi positivi			inferiori	superiori
ml 50	ml 10
0	0	0
0	1	1
0	2	2
0	3	4
0	4	5
0	5	7
1	0	2	0	6,0
1	1	3	0,1	12,6
1	2	6	0,5	19,2
1	3	9	1,6	29,4
1	4	16	3,3	52,9
1	5	>16	8	∞