ELETTROFORESI DELLE PROTEINE

ELETTROFORESI DELLE PROTEINE SU ACETATO DI CELLULOSA

 
1      SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE
2      PRINCIPIO DEL METODO
3      CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
4      MATERIALI E STRUMENTI
5      SOSTANZE E PRODOTTI CHIMICI
6      PROCEDIMENTO
7      ESPRESSIONE DEI RISULTATI

 ♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦♦

1     SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE

L’elettroforesi è un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche, attraverso una soluzione, sotto l’influenza di un campo elettrico applicato. Utilizzata generalmente nel campo ospedaliero e in chimica clinica per scopi diagnostici.

2     PRINCIPIO DEL METODO

Questa tecnica permette la separazione di macromolecole ed in particolare le proteine. Queste, poste in un ambiente basico, si comportano da acidi, perché il gruppo COOH dei vari amminoacidi che compongono la proteina, si dissocia in COOe H+ e quindi, complessivamente, si caricano negativamente e hanno mobilità elettroforetica dal polo negativo a quello positivo (le cariche negative superano quelle positive) e la proteina si muove verso il polo positivo (anodo). Il fenomeno della migrazione è legato a numerosi fattori dipendenti dalla natura del mezzo (in questo caso acetato di cellulosa) e dal campo elettrico applicato, inoltre essa dipende dalla massa, dimensione, carica e forma delle varie proteine, ossia dalla loro mobilità elettroforetica. Sottoponendo ad un campo elettrico, generato da una corrente continua, una miscela di proteine, quali ad es. le proteine sieriche, è possibile ottenere la loro separazione in almeno cinque frazioni principali:

  • Albumine
  • α 1 globuline
  • α 2 globuline
  • β globuline
  • Ɣ globuline

Schema allestimento

3     CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI

     I campioni di miscela proteica vanno tenuti in frigo a 5 °C; tutti i reagenti vanno preparati al momento d’impiego o se acquistati dalle ditte fornitrici seguire le indicazioni riportate sull’etichetta.

4          MATERIALI E STRUMENTI

  • Camera per elettroforesi (completa di ponte elettroforetico)  Camera migrazione elettroforesi
  • Alimentatore 200V continua Alimentatore elettroforesi
  • Depositore Depositore
  • Strisce di acetato di cellulosa
  • Pipetta Pasteur
  • Pinzetta punta piatta
  • Vaschetta in vetro per colorazione
  • Carta bibula
  • Lastrine di vetro per poggiarci le strisce di acetato di cellulosa
  • Foto densitometro per lettura strisce Fotodensitometro
  • Cilindro graduato da 250 cc
  • Pipetta graduata da 10 ml con propipetta
  • Bottiglia in vetro da 500 ml
  • Carta da filtro in fogli
  • Phon elettrico

5     SOSTANZE E PRODOTTI CHIMICI

6     PROCEDIMENTO

  • Immergere, tenendo con delle pinzette a punta piatta, le strisce di acetato di cellulosa per 10 minuti nella soluzione tampone;
  • Togliere l’eccesso di soluzione tampone fra due fogli di carta bibula;
  • Verificare la parte opaca, cioè la superficie penetrabile su cui si dovrà depositare il siero, in quantità 0,01 ml. Si può riconoscere la parte attiva posizionando l’angolo smussato della striscia in basso a destra;
  • Stendere l’acetato di cellulosa sul ponte della camera di migrazione;
  • Effettuare la deposizione del siero con apposito applicatore;
  • Chiudere con attenzione la camera elettroforetica;
  • Collegare l’alimentatore di corrente continua alla camera di migrazione rispettando le polarità (il campione di siero depositato deve stare dalla parte del polo negativo);

CAMERA E ALIMENTATORE

  • Applicare una tensione di 200 V continua per 30-35 minuti;
  • Al termine della migrazione scollegare l’alimentatore, aprire il coperchio della camera e con delle pinzette a punta piatta trasferire la striscia di acetato di cellulosa in una vaschetta con una soluzione di Rosso Ponceau per 5 minuti;
  • Decolorare, sotto cappa, con acido acetico al 5% fino a completa decolorazione ( 3-4 bagni con decolorante);
  • Disidratare, sotto cappa, la striscia con metanolo assoluto per 1 minuto;
  • Diafanizzare, sotto cappa, con una soluzione di acido acetico e metanolo ( 14 ml di metanolo e 86 ml di acido acetico conc.) per 1 minuto;
  • Tendere velocemente la striscia su una lastrina di vetro e farla aderire perfettamente;
  • Asciugare con un phon elettrico a modico calore fino a completa chiarificazione oppure lasciare il vetrino con la striscia in stufa a 60°-70°C per circa 15 minuti;
  • Leggere al fotodensitometro.

7     ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Valori normali delle sieroproteine

Proteine totali               6,0-8,0 g/dl

 

Albumina                                                                                3,6-4,9 g/dl             55% – 64%

Alfa 1 (α1-antitripsina, α1-glicoproteina acida)                       0,2-0,4 g/dl             2,2% – 4,5%

Alfa 2 (aptoglobina, α2-macroglobulina, α2-antiplasmina)     0,4-0,8 g/dl              7 % – 9 %

Beta globuline                                                                        0,6-1,0 g/dl              9 % – 13 %

Gamma globuline                                                                  0,9-1,4 g/dl             14 % – 18 %

 

Tracciato

Diversi tracciati elettroforetici con patologie connesse

CURVE ELETTROFORETICHE

Print Friendly, PDF & Email
(Visited 4.592 times, 1 visits today)
Rating: 5.0/5. From 1 vote.
Please wait...
Precedente Tensione o differenza di potenziale … Successivo Intensità di corrente elettrica

Lascia un commento

Questo sito usa Akismet per ridurre lo spam. Scopri come i tuoi dati vengono elaborati.