IMMUNODIFFUSIONE RADIALE DELLE PLASMAPROTEINE

Principio del metodo

Questa esperienza riguarda la determinazione quantitativa e qualitativa di alcune importanti plasmaproteine umane nel siero e nel plasma, attraverso l’uso della immunodiffusione radiale semplice. Il sistema prevede l’utilizzazione di una piastra con dei pozzetti contenente un anticorpo specifico incorporato nell’agarosio. Dopo la semina dell’antigene in un pozzetto della piastra, questo diffonde radialmente nelle maglie dell’agarosio, reagendo con l’anticorpo specifico per formare un anello visibile di precipitato. il diametro dell’anello è proporzionale alla quantità di antigene nel campione.

Materiali e reagenti

• Piastre contenenti gel di agarosio (con diversi pozzetti), con inglobato un anticorpo specifico  contro la plamoproteina che si vuole determinare, (le piastre possono essere acquistate pronte all’uso da ditte fornitrici specializzate);
• Micropipetta di precisione da 5μl;

• Lente di misura;

• Siero di controllo normale e patologico (fornito da ditte specializzate in cui sono riportati i valori di concentrazione delle plasmaproteine);
• PBS diluente la cui composizione è la seguente: NaCl 8,00g/l, KCl 0,20g/l, Na₂HPO₄*2H₂O 1,44g/l, KH₂PO₄ 0,24g/l, pH=7,4.

Raccolta e conservazione dei campioni

Possono essere utilizzati siero o plasma, fresco o conservato correttamente a 2-8°C, oppure, se non possono essere subito utilizzati, è possibile congelarli dopo il prelievo ed utilizzati successivamente. I campioni torbidi o con particelle in sospensione devono essere chiarificati mediante centrifugazione.

Preparazione del campione

In base al tipo di plasmaproteina che si sta cercando, utilizzare un campione diluito in PBS o in soluzione salina isotonica o non diluito come indicato nella tabella seguente:

 Procedimento

1. Lasciare la piastra con i pozzetti circa 5 minuti a temperatura ambiente per permettere l’evaporazione di eventuali goccioline di acqua di condensa nei pozzetti:
2. Inoculare, con pipetta di precisione, 5 μl del campione di cui si vuole determinare la concentrazione della plasmaproteina, seguendo le indicazione della tabella precedente;
3. In parallelo inoculare nei pozzetti adiacenti 5μl di siero di controllo per il Controllo di Qualità;
4. Chiudere la piastra con il suo coperchio, lasciare assorbire il campione per circa 20 minuti e capovolgerla lasciandola su un piano a temperatura ambiente per 48 ore.

Interpretazione dei risultati

Dopo 48 ore misurare, con apposito righello o con lente di misura, il diametro degli aloni in mm. Leggere sulle tabelle, allegate al kit della ditta fornitrice, in corrispondenza del diametro degli aloni, il valore della concentrazione della proteina. Nel caso in cui non si lavori con un kit, confrontare i diametri degli aloni di precipitazione, del campione in esame, con quelli ottenuti inoculando nei pozzetti adiacenti, concentrazioni note scalari di uno standard di plasmaproteina.

Eliminazione del materiale usato

Dopo l’utilizzazione le piastre e il materiale venuto a contatto con il campione in esame devono essere decontaminati e smaltiti in accordo con le tecniche in uso in laboratorio per la decontaminazione e lo smaltimento di materiale potenzialmente infetto.