Pseudomonas aeruginosa nelle acque

Pseudomonas aeruginosa è un microrganismo caratterizzato da un’elevata capacità di adattamento e si trova nelle acque superficiali, reflue e marine, suoli, vegetazione e in generale in tutti gli ambienti umidi. È un microrganismo prettamente ambientale e per questo rilevabile anche in acque sotterranee e in acque potabili dove può essere riscontrato in concentrazioni ampiamente variabili. In particolare, è facilmente rilevabile in condizioni di stagnamento di acqua ed è in grado di installarsi nei serbatoi, nei rompigetto dei rubinetti e nelle apparecchiature ad uso domestico per il trattamento di acque potabili, raggiungendo cariche batteriche elevate. La sua presenza è di norma considerata indice di cattiva procedura di confezionamento delle acque messe in vendita in bottiglia o in contenitori. Pseudomonas aeruginosa si caratterizza per essere multi-resistente agli antibiotici, rappresentando quindi un rischio per la salute in ambienti ospedalieri dove può provocare infezioni delle vie urinarie, delle ustioni e delle ferite, ulcere corneali e cheratiti, setticemie, gastroenteriti nei neonati, ascessi, broncopolmoniti e meningiti. La sua attività patogena è dovuta alla sua capacità invasiva e alla produzione di sostanze extracellulari, quali alcune proteasi, tossine emolitiche, enterotossine e la tossina letale, esotossina A.

La ricerca di Ps. aeruginosa nelle acque destinate al consumo umano in distribuzione ha una rilevanza legata prevalentemente alla verifica dell’efficacia del trattamento a cui sono soggette le acque. Il parametro è inserito tra quelli indicati nell’Avvertenza dell’Allegato I del Decreto Legislativo n. 31 del 2001 e successive modifiche ed integrazioni e va interpretato quindi come indicatore di qualità delle acque potabili in rete. Lo stesso decreto impone lo svolgimento di controlli del grado di protezione dell’acqua dall’ambiente esterno durante il confezionamento di acque imbottigliate anche per la verifica del mantenimento di condizioni di buona qualità dell’acqua durante la conservazione. In questo caso, come patogeno opportunista in grado di moltiplicarsi in condizioni statiche dell’acqua, Ps. aeruginosa deve essere obbligatoriamente assente nelle acque destinate al consumo umano messe in vendita in bottiglia o in contenitori.

Pseudomonas aeruginosa appartiene alla famiglia delle Pseudomonadaceae ed è un bacillo di piccole dimensioni con lunghezza di 1,5±3 μm e larghezza compresa tra 0,5 e 0,7 μm, Gram negativo, aerobio, asporigeno, motili tramite uno o più flagelli polari, possiede una capsula ed la maggioranza dei ceppi cresce a 42°C ma non a 4°C. Ps. aeruginosa si caratterizza per la produzione di pigmenti: piocianina, prodotta solo da Ps. aeruginosa, solubile in acqua, di colore verde-blu, piorubina, insolubile in acqua, di colore rossastro-marrone e fluoresceina o pioverdina, solubile in acqua, di colore dal giallo-verde al giallo-bruno e fluorescente all’ultravioletto.

Pseudomonas aeruginosaPer quanto riguarda il comportamento biochimico risulta positivo alla citocromo ossidasi (che lo distingue dagli enterobatteri), ossidasi positivo, citrato (Simmons) positivo, arginina diidrolasi positivo, lisina e ornitina decarbossilasi negativo.

P aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa Gram negativo

La procedura analitica viene utilizzata per il rilevamento di Pseudomonas aeruginosa nelle acque sorgive, sotterranee e superficiali, destinate o da destinare al consumo umano e nelle acque ad uso ricreativo (piscine).

Riferimenti

Il metodo d’analisi che verrà descritto, segue i riferimenti EN 12780/99, ISO 8199-2005, DLGS n.31 del 02/02/2001 e i rapporti ISTISAN 00/14.

Principio del metodo

Il metodo fa uso della tecnica delle membrane filtranti e di terreni di coltura che accentuano alcune peculiarità che contraddistinguono P. aeruginosa: produzione dei pigmenti e resistenza agli antimicrobici.

Interferenze e cause d’errore

La metodica può essere eseguita solo su campioni di acqua prive di torbidità.

Conservazione dei campioni

Tenere i campioni di acqua ad una temperatura di +4°C e +10°C e al riparo della luce. L’analisi deve essere effettuata entro 24 ore dal prelievo e alla temperatura ambiente.

Apparecchiatura e materiali

  • Autoclave;
  • Incubatore a 36°C ± 2°C;
  • Bilancia tecnica;
  • Lampada di Wood con lunghezza d’onda 360±20 nm;
  • Piastre petri e pipette sterili da 1 e 2 ml. Membrane sterili da 0,45μm;
  • Phmetro;
  • Attrezzatura membrane filtranti;
  • Microscopio ottico

Terreni di coltura e reagenti

  • Agar base Pseudomonas (CN-agar) oppure agar alla cetrimide (CAB);
  • Supplemento CN la cui composizione: Cetrimide 0,2 g e Acido nalidixico 15 mg in 2ml acqua distillata;
  • Agar nutrient o simile;
  • Terreno di King;
  • Reattivo di Kovacs per rilevamento enzima citocromossidasi (Tetrametil-parafenilendiamina dicloridrato);
  • Soluzione ringer 1:4 sterile in provette per diluizioni;
  • Kit colorazione di Gram.

PROCEDIMENTO

Il campione deve essere diluito nel caso in cui si sospetti una elevata carica batterica o per eliminare le interferenze dovute alla presenza di particelle sospese. La diluizione si esegue con il metodo della progressione geometrica in base 10.

Filtrare un volume del campione o della sua diluizione (250 ml per acque di rete) e posizionare la membrana da 0,45 μm sulla superficie del terreno selettivo (CAB o CN-agar).

membrane estrazione2
Preparazione della membrana filtrante sterile – Img per gentile concessione IVABiolSan

Incubare a 36°C ± 2 per 24-48 ore. La specie Pseudomonas, essendo resistente alla cetrimide (bromuro di cetiltrimetilammonio, derivato dei sali quaternari d’ammonio), sviluppa sul CAB (Agar cetrimide), di cui la composizione è la seguente: per 1 litro di terreno:

  • Digerito pancreatico di gelatina……………………… 20,0 g
  • Cetrimide …………………………………………………….. 0,3 g
  • Magnesio cloruro…………………………………………… 1,4 g
  • Potassio solfato…………………………………………… 10,0 g
  • Agar batteriologico……………………………………….. 15,0 g
  • pH del terreno pronto per l’uso a 25°C: 7,2 ± 0,2.
Il cetrimide (bromuro di cetiltrimetilammonio) è un ammonio quaternario che inibisce un gran numero di batteri, tra cui le specie Pseudomonas diverse da Pseudomonas aeruginosa. La produzione di piocianina (un pigmento blu solubile in acqua e cloroformio) è stimolata dal cloruro di magnesio e dal solfato di potassio. Il terreno favorisce inoltre la produzione di pigmenti fluorescenti (pioverdine) da parte di alcuni ceppi di Pseudomonas aeruginosa.
Pseudomonas cetrimide
Su questo terreno le colonie si presentano piatte, tonde e sono circondate da una caratteristica pigmentazione blu o blu-verde che diventano fluorescenti sotto una luce ultravioletta a 254 nm (usare lampada di Wood con lunghezza d’onda di 360±20 nm). Le colonie sospette verranno coltivate su Agar nutrient, incubate a 36°C per 24 ore e successivamente sottoposte a verifiche morfo-biochimiche con prove aggiuntive.
Semina su Pseudomonas agar/CN la cui composizione è:
Terreno di base:
  • Peptone gelatina………………………….. 16 g
  • Caseina idrolisata………………………… 10 g
  • Solfato di potassio anidro……………… 10 g
  • Cloruro di magnesio anidro………….. 1,4 g
  • Glicerolo…………………………………….. 10 ml
  • Agar…………………………………………… 15 g
  • Acqua distillata…………………………. 1000 ml

Il terreno di base si trova anche in commercio in forma disidratata. Reidratare il terreno in acqua distillata secondo le istruzioni della ditta produttrice. Riscaldare fino ad ebollizione agitando frequentemente. Sterilizzare in autoclave a 121±3°C per 15 min. Raffreddare a 50±5°C.
Aggiungere il supplemento.

Supplemento CN

  • Cetrimide (cetiltrimetilammonio bromuro) 0,2 g
  • Acido nalidixico 15 ml
Il supplemento è disponibile in commercio. Ricostituire in 2 ml di acqua distillata sterile. Aggiungere il supplemento asetticamente a 1 litro di terreno di base raffreddato e mescolare. Il prodotto è classificato come T – Tossico per la presenza di acido nalidixico.
Terreno completo Pseudomonas agar/CN
  • Terreno di base………………………………………. 1000ml
  • Pseudomonas agar/CN Supplemento CN……… 2 ml
  • pH 7,1±0,2

Aggiungere ad 1 litro di terreno di base 2 ml di supplemento. Agitare per ottenere una soluzione omogenea e, rispettando le comuni regole di asepsi, distribuire in capsule di Petri. Non mantenere fuso il terreno per più di 4 ore. Conservare a 5±3°C a riparo dalla luce per non più di un mese in condizioni ottimali. Per controlli di qualità è consigliabile utilizzare come controllo positivo Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 o NCTC 10332 e come controllo negativo E. coli ATCC 25922 o NCTC 9001; in ogni caso, comunque utilizzare colture di riferimento certificate.

Verificare dopo 22±2 ore e dopo 44±4 ore la crescita di colonie tipiche sul terreno Pseudomonas agar/CN. Ps. aeruginosa può sviluppare colonie di colore verde-blu che producono piocianina, fluorescenti e marrone-rossastro.
Pseudomonas su CN
Colonie di P. aeruginosa su P. agar/CN

Contare tutte le colonie di colore verde-blu e considerarle come colonie confermate di Ps. aeruginosa. Sottoporre a conferma le colonie risultate fluorescenti (Ps. aeruginosa presuntivo) alla lampada di Wood, procedendo alla verifica della produzione di ammonio da acetamide, e quelle che hanno prodotto un pigmento di colore marrone-rossastro (Ps. aeruginosa presuntivo), procedendo all’esecuzione delle prove relative alla produzione di ammonio da acetamide, alla verifica della presenza della citocromossidasi, alla produzione di fluorescenza. Circa il 10% dei biotipi di Ps. aeruginosa non produce pigmento. Non esporre troppo a lungo le colonie alla luce ultravioletta onde evitare danni ai microrganismi che potrebbero essere resi non vitali, inficiando quindi le prove successive.

TEST DI CONFERMA
Le colonie isolate devono essere sottoposte ai seguenti test di conferma:
Prova della citocromossidasi: Con il reagente di Kovacs (soluzione 1% in acqua distillata di N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilenediammina dicloroidrato). Prelevare dall’agar Nutritivo, seguendo le usuali regole di asepsi, con un’ansa sterile le colonie che, in primo isolamento, avevano prodotto un pigmento blu o blu-verdi e strisciarle su una carta da filtro imbibita del reattivo di Kovacs preparato al momento dell’uso. I microrganismi citocromossidasi-positivi producono una reazione che sviluppa una colorazione blu-violetto entro pochi secondi. Una reazione negativa si manifesta con il mancato sviluppo di colore. Ps. aeruginosa è citocromossidasi-positivo come anche le altre specie di Pseudomonas.
test citocromossidasi
– Verifica della produzione di fluorescenza: Seguendo le usuali regole di asepsi, con un’ansa sterile, prelevare dall’Agar Nutritivo le colonie che, in primo isolamento, avevano prodotto un pigmento blu o blu-verdi e che sono risultate citocromossidasi-positive e isolarle sul terreno di King dalla seguente composizione:
Terreno B di base di King
Composizione
  • Peptone…………………………………….. 20 g
  • Dipotassio idrogeno fosfato………….1,5 g
  • Magnesio solfato eptaidrato………….1,5 g
  • Agar…………………………………………. 15 g
  • Acqua distillata………………………… 1000 ml

Il terreno di base si trova anche in commercio in forma disidratata. Reidratare il terreno in acqua distillatasecondo le istruzioni della ditta produttrice. Riscaldare fino ad ebollizione agitando frequentemente. Aggiungere glicerolo.

Terreno B completo di King
Composizione

  • Terreno B di base di King……….1000 ml
  • Glicerolo………………………………. 10 ml
  • pH 7,2±0,2

Aggiungere a 1 litro di terreno di base 10 ml di glicerolo. Agitare per ottenere una soluzione omogenea e, rispettando le comuni regole di asepsi, distribuire in tubi in ragione di 5 ml/tubo. Sterilizzare in autoclave a 121±3°C per 15 min. Conservare a 5±3°C a riparo dalla luce per non più di tre mesi in condizioni ottimali. Incubare fino a 5 giorni a 36±1°C, sebbene l’eventuale positività della prova sia, generalmente, già evidenziabile dopo 24 ore. Dopo incubazione, osservare, con la lampada di Wood, la produzione di fluorescenza e registrare come positive per Ps. aeruginosa tutte le colonie fluorescenti.

Pseudomonas UV
Pseudomonas UV cavazza2
Pseudomonas aeruginosa visto agli UV “Img per gentile concessione IVABiolSan”
Le colonie con pigmento blu o blu-verdi in primo isolamento, citocromossidasi-positive e fluorescenti sul terreno di King sono da considerarsi confermate come Ps. aeruginosa;
– Prova della crescita a 42°C: Prelevare con un’ansa sterile la colonia sospetta, strisciarla su Agar Nutritivo e incubare a 43±1°C per 48±2 ore. I microrganismi appartenenti alla specie Pseudomonas aeruginosa sono in grado di crescere a questa temperatura di incubazione; pertanto, il risultato è positivo quando si ha lo sviluppo della colonia.
Per controlli di qualità è consigliabile utilizzare come controllo positivo Pseudomonas aeruginosa NCTC 10332 o ATCC 9027 e come controllo negativo Pseudomonas fluorescens ATCC 13525; in ogni caso, comunque utilizzare colture di riferimento certificate.

Verifica della produzione di ammonio: Sottoporre alla verifica della produzione di ammonio le colonie fluorescenti e quelle che hanno prodotto un pigmento marrone-rossastro su P. agar/CN. Inoculare ciascuna colonia sospetta cresciuta su Agar Nutritivo in un tubo contenente il Brodo all’acetamide dalla seguente composizione:

Brodo all’acetamideSoluzione A

  • Potassio diidrogeno fosfato…….. 1 g
  • Magnesio solfato anidro………. 0,2 g
  • Acetamide……………………………. 2 g
  • Sodio cloruro ……………………..0,2 g
  • Acqua distillata…………………. 900 ml
  • pH 7,0±0,5

Sciogliere gli ingredienti in acqua distillata. La soluzione è tossica per la presenza di acetamide. Il prodotto potrebbe avere effetti cancerogeni (R45) e mutageni. Il suo utilizzo richiede, da parte degli operatori, particolari precauzioni durante la manipolazione e lo smaltimento: protezione respiratoria (mascherina antipolvere e uso di cappa aspirante), protezione delle mani (guanti protettivi), protezione della pelle (indumenti protettivi). Evitare il contatto con sostanze infiammabili, acidi e basi forti.

Brodo all’acetamideSoluzione B

  • Sodio molibdato…….. 0,5 g
  • Ferro solfato……….. 0,05 g
  • Acqua distillata…… 100 ml

Sciogliere gli ingredienti in acqua distillata.

Brodo all’acetamideSoluzione completa

  • Soluzione A……… 900 ml
  • Soluzione B………… 1 ml
  • Acqua distillata

Aggiungere a 900 ml di soluzione A, 1 ml di soluzione B e portare a volume di 1 litro con acqua distillata mescolando continuamente. Distribuire in tubi in ragione di 5 ml/tubo e sterilizzare in autoclave a 121±3°C per 15 min. Conservare a 5±3°C a riparo dalla luce per non più di tre mesi in condizioni ottimali.

Incubare a 36±1°C per 22±2 ore. Dopo incubazione aggiungere 1-2 gocce di Reattivo di Nessler, la cui composizione è:

  • Cloruro di mercurio……… 10 g
  • Potassio ioduro……………. 7 g
  • Idrossido di sodio……….. 16 g
  • Acqua distillata

La soluzione è anche disponibile in commercio; in alternativa sciogliere il cloruro di mercurio e lo ioduro di potassio in un volume ridotto di acqua distillata. Mescolando, aggiungere lentamente la soluzione all’idrossido di sodio disciolto in 50 ml di acqua distillata. Portare a volume di 100 ml. Conservare in bottiglie di vetro borosilicato con tappo di gomma a riparo dalla luce per non più di un anno. La soluzione è tossica per la presenza di cloruro di mercurio. Il suo utilizzo richiede, da parte degli operatori, particolari precauzioni durante la manipolazione e lo smaltimento: protezione respiratoria (mascherina antipolvere e uso di cappa aspirante), protezione delle mani (guanti protettivi), protezione della pelle (indumenti protettivi).

Verificare la produzione di ammonio che si manifesta con una colorazione compresa tra il giallo e il rosso-mattone. Le colonie risultate sia fluorescenti sul terreno di isolamento, sia positive per la produzione di ammonio sono confermate come Ps. aeruginosa. Procedere alle successive prove di conferma per le colonie con pigmento marrone-rossastro e positive per la produzione di ammonio.

In sintesi Pseudomonas aeruginosa risulta verificata quando si dimostra:
  • presenza del sistema citocromoossidasi;
  • crescita a 42ºC ± 1ºC per 24 ore;
  • produzione di pigmento diffusibile;
  • produzione di ammonio da acetamide;
  • presenza bastoncelli gram negativi (colorazione di Gram);
  • motilità con l’esame a fresco su vetrino;
  • fermentazione negativa al lattosio;
  • metabolismo di tipo ossidativo, test ossido/fermentazione (O/F), O positivi.

 Espressione dei risultati

La legge impone, per le acque destinate al consumo umano, la totale assenza dello P. aeruginosa. Per le acque destinate al consumo umano messe in vendita in bottiglie o contenitori e per quelle in distribuzione, riportare il numero di Pseudomonas aeruginosa come UFC/250 ml (Unità Formanti Colonia). Per le acque destinate al consumo umano in distribuzione è, in alternativa, possibile esprimere il risultato come Pseudomonas aeruginosa Presente o Assente/250 ml; per le acque di piscina il valore deve essere riferito a 100 ml.  Per assicurare l’attendibilità dei risultati è opportuno eseguire, dallo stesso operatore, l’analisi in doppio sugli stessi campioni, con medesimi inoculi, utilizzando medesima apparecchiatura e materiali. Nel caso in cui vi sia una certa carica batterica, ricavare: la “Media aritmetica”, la “Deviazione standard”, il “Chi quadro” per verificare la validità del conteggio e il “Calcolo fiduciale della media” (errore standard E).

Quando è richiesto il limite di confidenza al 95%, con i limiti inferiore e superiore, in prove di ripetibilità (in genere prove in doppio), si applica la seguente equazione:

  Y ± 95% CI
per Z > 20    intervallo di confidenza (CI) al 95%, i limiti superiore e inferiore sono calcolati dalla:

\(Y±CI = \frac{((Z)\pm 2\sqrt{(Z)})}{Vt}\times Vs \)

per Z < 20 intervallo di confidenza (CI) al 95%, i limiti superiore e inferiore sono calcolati dalla:

\(Y±CI = \frac{((Z)+2\pm 2\sqrt{(Z)+1)})}{Vt}\times Vs \)

dove:

Z = somma delle colonie nelle piastre utilizzate in prove di ripetibilità
Vt = volume totale che tiene conto delle diluizioni eventuali effettuate n, del volume filtrato e del numero delle piastre utilizzate ni per la verifica: S (ni xvi xn)
Vs = volume di riferimento scelto per esprimere la concentrazione del microrganismo.
Y = stima del numero di microbi, espresso in ufc nel volume di riferimento del campione
CI = Intervallo di confidenza

Bibliografia

Allen M, Edberg S, and Reasoner D. Heterotrophic plate count (HPC) bacteria – What is their
significance in drinking water? In: Proceedings of the NFS International/WHO Symposium on Bacteria in drinking water. Public health implications? Geneve, 2002.
Davis B.D., Dulbecco R., Eisen H.N., Ginsberg H.S., Wood W.B., McCarty M. Trattato di Microbiologia, Piccin Editore, Padova, 1981: 900 – 902.
UNI EN 12780: 2002. Qualità dell’acqua – Ricerca e conteggio di Pseudomonas aeruginosa attraverso la filtrazione su membrana.

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