Ricerca Staphylococcus Aureus

Gli Stafilococchi aurei sono dei cocchi che si dispongono in ammassi e, osservandoli al microscopio ottico, sembrano assumere la forma di un grappolo d’uva. Sono patogeni per l’uomo e possono essere responsabili di una vasta gamma di infezioni superficiali ed anche intossicazioni alimentari. Per studiarli quindi, bisogna lavorare seguendo tutte gli accorgimenti possibili per non infettarsi. L’uso della cappa sterile a flusso laminare, una mascherina, un camice, un paio di guanti e degli occhialetti, sarebbero sufficienti a garantire una buona protezione. Ovviamente è opportuno che ci sia sempre un professore esperto che segua, passo passo, tutte le operazioni.

La ricerca ed identificazione dello Staphylococcus aureus si basa soprattutto nell’esaminare la crescita su alcuni particolari terreni di coltura che evidenziano alcune caratteristiche tipiche di questi microrganismi. Se il campione  in esame presenta un’alta probabilità che possa contenere gli Stafilococchi si potrebbe tentare di farli crescere ed isolarli su un terreno selettivo e differenziale come ad esempio l’agar sale mannite. Questo terreno presenta, nella sua composizione, un’alta concentrazione di NaCl (75g/l, più del doppio della salinità marina), mannitolo (10g/l), indicatore di pH rosso fenolo allo 0,25‰, estratto di carne (1g/l) e peptone (10g/l). L’alta concentrazione di NaCl permette l’isolamento degli stafilococchi alofili, dal resto della flora batterica che viene inibita. E’ possibile anche poter individuare le colonie mannitolo fermentanti, da quelle che non lo sono, grazie alla presenza di una zona colorata in giallo attorno alle colonie stesse che si presentano tondeggianti, di pochi mm di diametro e con margine intero.

SAureus MSAQuesta zona colorata è dovuta all’acidificazione del terreno per la presenza di metaboliti prodotti nella fermentazione del mannitolo ad opera dello stafilococco e rivelata grazie al rosso fenolo che vira dal rosso, in ambiente basico, al giallo, in ambiente acido. Le colonie gialle presenti nell’M.S.A. (acronimo di Mannitol Salt Agar) devono essere testate ulteriormente con delle prove di conferma per essere sicuri di aver isolato lo Staphylococcus aures. E’ importante anche verificare che siano Gram positivi effettuando la colorazione di Gram.

                                                                Stafilococchi Gram positivi

Si eseguono quindi, delle colture di mantenimento in un terreno ricco di nutrienti, come il B.H.I. (Brain Heart Infusion Broth) ovvero in un brodo cuore infuso cervello, per far moltiplicare e mantenere i microrganismi di presunto S.Aures. Dopo 24 ore di incubazione a 37ºC, si potranno eseguire alcuni test che ci permettono di determinare il corredo enzimatico delle cellule campione.

Coagulasi test: uno dei test, importanti per l’dentificazione dello S.Aureus, è quello della ricerca della coagulasi stafilococcica che agisce sul fibrinogeno trasformandolo in fibrina formando così un coagulo. Ciò fa sì che si formi un grumo attorno alla S. aureus che protegge e nasconde il batterio nelle prime fasi dell’infezione. La coagulasi è un enzima, liberato da questi batteri  patogeni, in grado di coagulare il plasma citrato di coniglio in un minuto. Per effettuare il test in laboratorio si utilizzano 0,5 ml di plasma citratato di coniglio contenuti in una provettina. Si aggiunge una colonia e, dopo aver stemperato si incuba in termostato a 37°C. Si controlla se, entro un massimo di 4h, vi è la formazione di un coagulo solido confermando o meno la positività della reazione.

coagulasi copy

Catalasi test: un altro test, di facile esecuzione, è la ricerca della Catalasi. Questa è un enzima, in grado di utilizzare l’acqua ossigenata, scindendola in acqua e ossigeno.
2H2O2 + Catalasi → 2H2O + O2

Si preleva una colonia tipica da MSA e si stempera nella zona centrale di un vetrino portaoggetti. Si aggiunge una goccia di acqua ossigenata e si osserva cosa succede. Se si formano bollicine, i microrganismi in esame, possiedono la catalasi altrimenti, se non si nota nessuna variazione, non possiedono l’enzima.

DNasi test: la dimostrazione della produzione di Dnasi è anche questo un valido test che permette l’identificazione degli stafilococchi patogeni. Il terreno da utilizzare è proprio il DNase Agar la cui composizione é:

Miscela selezionata di peptoni 20,0 g/l
Cloruro di sodio 5,0 g/l
Acido deossiribonucleico 5,0 g/l
Agar 14,0 g/l
pH 7,3 ± 0,2

Dopo averlo sterilizzato in autoclave a 121°C (1atm) per 15 minuti, si versa in piastra e si lascia solidificare. Inoculare le piastre con alcune gocce di una sospensione del microrganismo in esame per ottenere, dopo incubazione (18-24 ore a 35-37°C), pesanti zone di crescita. Inondare le piastre con HCl 1M e attendere lo sviluppo della reazione, finchè non risulta visibile opacità nel terreno. Eliminare l’acido in eccesso e valutare la trasparenza attorno alle zone di crescita. Una zona di trasparenza chiaramente definita indica che il DNA è stato scisso in frazioni nucleotidiche che non sono precipitate in presenza di acido. Tale condizione è da attribuire alla presenza di microrganismi Dnasi positivi.

Dnasi testLe colonie Dnasi negative non mostrano trasparenza. Lo Staphylococcus aureus è positivo e lo S. epidermidis è negativo.

Comportamento su terreno Baird Parker: interessante è anche vedere come si presentano gli stafilococchi quando vengono seminati su un terreno di coltura particolare come il Baird Parker dalla seguente composizione per litro di prodotto:
Peptone di caseina 10,0 g
Estratto di carne 5,0 g
Estratto di lievito 1,0 g
Piruvato di sodio 10,0 g
Glicina 12,0 g
Litio cloruro 5,0 g
Tellurito di potassio 0,1 g
Rosso d’uovo 50 ml
Agar 22,0 g
pH 6,8 ± 0,2
Il terreno è opaco e di colore giallognolo.

Il Baird Parker Agar è un terreno di coltura selettivo. La sua composizione facilita la rilevazione dei microrganismi ricercati (S. aureus) e l’aggiunta di sostanze inibenti impedisce allo stesso tempo la crescita della flora batterica contaminante grazie all’azione della Glicina e del Cloruro di Litio. Il tellurito di potassio inibisce i batteri gram negativi e parte dei gram positivi, capaci di lisare il tuorlo d’uovo. Il tellurito viene ridotto a tellurio dagli stafilococchi che formano colonie nere translucide. Il tuorlo d’uovo consente l’identificazione dei positivi attraverso la rilevazione dell’attività enzimatica della lecitinasi (alone opaco intorno alle colonie) e della lipasi (alone di lisi intorno all’alone opaco) di S. aureus.

SAureus BParkerEventuale presenza di colonie molto piccole, grigio-nere, translucide e senza alone di lisi sono tipiche dello Stapylococcus epidermidis.

Test della Proteina A: vi sono tanti altri test che si possono effettuare per avere ulteriori conferme come ad esempio la ricerca e identificazione della proteina A. Questa è situata nella parete cellulare e può legare la porzione (Fc) di alcune immunoglobuline provocando l’inibizione della fagocitosi del batterio, l’attivazione del sistema complemento e provocare delle reazioni di stimolazione della moltiplicazione linfocitaria.

Il 99% di S. aureus isolati producono livelli rilevabili di proteina A sulla loro superficie; una caratteristica che può essere utilizzata per differenziare S. aureus da altre specie di stafilococchi in cui questa proteina è rara.

Il test della proteina A è di tipo immunologico e sfrutta una reazione di agglutinazione ben osservabile ad occhio nudo. Si aggiunge una goccia di siero anti-proteina A e una goccia di sospensione ricca di S.Aureus su di un vetrino o si stempera una colonia tipica proveniente ad esempio da MSA. La formazione di grumi, tipici di una reazione di agglutinazione, entro pochi minuti, identificano la presenza di proteina A e quindi, conferma dello S.Aureus.proteina A test ok

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2 commenti su “Ricerca Staphylococcus Aureus

  1. Grazie per la lettura, una trattazione degli stafilococchi interessante e tutta da leggere.

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    • KirkadminKirkadmin il said:

      Grazie anche te per i tuoi ottimi articoli.

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