Colorazione di Gram
La colorazione di Gram è un procedimento ideato e messo a punto nel 1884 da un batteriologo danese, Hans Christian Gram e rappresenta la metodologia più in uso per classificare i batteri Gram positivi e Gram negativi. Prima di inoltrarci nella descrizione della tecnica rivediamo alcuni cenni sulla struttura della parete cellulare dei batteri.
Parete batterica di Gram positivi e Gram negativi
(Libro consigliato:Laboratorio di microbiologia e biochimica Ed. Zanichelli)
La parete svolge funzioni fondamentali per la cellula batterica, quali regolazione della pressione osmotica, protezione della membrana plasmatica da ambiente esterno e regolazione dell’entrata dei nutrienti nella cellula. Non in tutti i batteri però ha la stessa composizione chimica ed è questo che ha permesso la distinzione in Gram positivi e negativi.
La parete cellulare dei gram-positivi è uniforme e relativamente spessa (20-80 nm) ed è formata per il 90% da mureina (peptidoglicano) e da componenti quantitativamente minori come acidi teicoici, acidi teucuronici e proteine. La mureina è composta da due tipi di catene che intrecciandosi tra loro e formando numerosi strati conferiscono rigidità nonché spessore alla parete. Queste sono:
- catene glicaniche formate dalla successione lineare di due zuccheri modificati che si ripetono alternativamente, ossia N-acetilglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM) uniti da legami β (1-4) glicosidici;
- catene peptidiche formate dall’unione di un pentapeptide (coda di cinque amminoicidi) al NAM attraverso un legame peptidico.
Nei gram-negativi la parete è formata soltato dal 15-20% di mureina, che inoltre risulta essere monostratificata, per il fatto che non tutti i NAM si legano con un pentapeptide, diminuendo la possibilità di formare legami crociati. Ciò che li distingue dai gram+ è la presenza di una membrana esterna formata da un doppio strato fosfolipidico, che rappresenta una prima barriera al passaggio di sostanze. In essa sono presenti:
- proteine della membrana esterna (Omp ovvero Outer Membrane Proteins), che veicolano il passaggio di molecole idrofile attraverso il doppio strato fosfolipidico;
- Lipopolisaccaridi (LPS) formati da una componente lipidica e una polisaccaridica;
- Lipoproteine formate da una componente lipidica intramembranale e una proteica che sporge sul lato periplasmatico (spazio tra membrana esterna e strato di mureina) legandosi alla mureina.
Colorazione di Gram
Obiettivo: Determinare se nel campione da analizzare siano presenti microorganismi gram-positivi o gram-negativi.
Materiale occorrente:
- Microscopio ottico;
- Colture batteriche;
- Vetrini portaoggetti;
- Bacinella con supporto per vetrini;
- Ansa di platino o al Ni/Cr;
- Spruzzetta;
- Sostegni per vetrini portaoggetti;
- Becco bunsen;
- Carta da filtro.
Reagenti:
- Cristal violetto (violetto di genziana), soluzione 1:10 in acqua distillata della soluzione madre di cristalvioletto;
- Lugol (soluzione iodo-iodurata costituita da 1g di Iodio, 2g di Ioduro di potassio e 300ml di acqua distillata);
- Decolorante (alcool etilico al 70%);
- Acqua distillata;
- Fucsina basica per Ziehl-Neelsen (soluzione 1:10 in acqua distillata) oppure Safranina (soluzione 1:10 in acqua distillata);
- Olio per immersione.
Valutazione dei rischi:
Indossare i dispositivi di protezione individuali come il camice, guanti da chirurgo, occhialetti e lavorare sotto cappa d’aspirazione facendo attenzione alla fiamma del becco bunsen. I reattivi di scarto vanno eliminati attraverso le procedure previste dalla normativa riguardo i rifiuti tossici e nocivi. L’esperienza va fatta in ogni caso con la presenza di docenti di laboratorio.
Preparazione del vetrino:
Prima di iniziare la colorazione di Gram, bisogna preparare il vetrino portaoggetti con il campione di cellule batteriche da analizzare. Si eseguono quindi delle operazioni che prevedono la Distensione del materiale batterico sul vetrino portaoggetti, l’Essiccazione e la Fissazione dello stesso. Tali operazioni definite spesso in ambito laboratoristico DEF, sono fondamentali per poter eseguire la colorazione impedendo l’allontanamento delle cellule batteriche dal vetrino portaoggetti durante l’utilizzo delle varie soluzioni impiegate nella colorazione.
Con la Distensione si stempera una goccia di sospensione di materiale batterico su di un vetrino portaoggetti distribuendola nella parte centrale fino a formare una sottile pellicola.
Con l’Essiccazione si pone il vetrino a modico calore (ad una certa altezza della fiamma circa 30-40 cm), in modo da far evaporare la parte liquida del preparato.
Infine con la Fissazione, i microorganismi vengono uccisi e bloccati sul vetrino stesso (fissazione a caldo). Si accarezza la fiamma passandoci sopra il vetrino, con il materiale batterico essiccato, per almeno 3 volte velocemente.
Dopo aver preparato lo striscio, si può procedere con la colorazione vera e propria.
Procedimento della colorazione di Gram:
- Si ricopre lo striscio fissato a caldo con il primo colorante cristalvioletto (violetto di genziana) per 1minuto;
- Gettare l’eccesso di colorante senza lavare con acqua;
- Mordenzare per circa 30 secondi con la soluzione di Lugol (una soluzione acquosa di iodio e ioduro di potassio, definita mordenzante, poiché in grado di fissare il colore). La soluzione di Lugol è polare e penetra nella cellula batterica dove incontra il cristalvioletto con cui forma un complesso idrofobico.
Dal momento che la parete cellulare dei Gram-positivi è polare, il complesso idrofobico cristalvioletto-iodio non può attraversarla rimanendo così bloccato all’interno della cellula batterica stessa. A questo punto al microscopio i batteri appaiono tutti uniformemente colorati in violetto;
- Decolorare con alcool etilico, fino a che il preparato non cede più colore, per non più di 10 secondi, altrimenti, un’azione prolungata, potrebbe allontanare il primo colorante anche dai gram-positivi creando false negatività. Al termine di questa fase, le cellule dei batteri Gram-positivi avranno trattenuto il colore viola. Le cellule dei Gram-negativi, invece, si saranno decolorate. Questo avviene perché l’alcool attacca la struttura lipopolisaccaridica della membrana esterna tipica dei Gram-negativi e assente nei Gram-positivi, agevolando così la perdita del colorante precedentemente assorbito;
- Lavare con acqua subito dopo il trattamento con il decolorante;
- Ricoprireil preparato con il colorante di contrasto per pochi secondi con la fucsina di Ziehl o per 30 secondi con la safranina;
- Lavare con acqua ed essiccare all’aria;
- Alla fine della colorazione, osservare al microscopio ottico con l’obiettivo ad immersione. I Gram positivi appariranno colorati in violetto e i Gram negativi in rosso.
Osservazioni:
Il primo colorante (cristalvioletto) colora tutte le cellule batteriche indifferentemente in quanto viene inglobato nello strato di peptidoglicano. La decolorazione fa in modo che solo i gram negativi si decolorino in quanto l’alcool attacca le strutture lipopolisaccaridiche della membrana esterna che, disciogliendosi, permettono al colorante di fuoriuscire dal sottile strato di peptidoglicano. A questo punto i gram negativi sono incolori e saranno meglio visibili soltanto con il secondo colorante, che li farà apparire di colore rosa-rosso.
Conclusioni:
In conclusione, ad oggi la colorazione di Gram rimane un ottimo strumento di classificazione batteriologica che permette di indirizzare le ulteriori indagini per la determinazione delle specie batteriche presenti in un materiale batterico che si dovrà analizzare.
Vetrini preparati dagli studenti:
Le foto di seguito riportate sono dei vetrini con dei microorganismi isolati da un’acqua di pozzo (Gram-negativi) e dei lieviti Gram-positivi. Foto effettuate con la telecamera dei telefonini.
