ESAME MORFOLOGICO DEL SANGUE

Obiettivo

Con l’esame morfologico del sangue si intende differenziare gli elementi figurati del sangue, tramite la colorazione di May Grunwald-Giemsa, per poterli riconoscere e contare. Evidenziare anche la presenza di eventuali cellule anomale.

Materiale

Vetrino porta-oggetti, Pipetta Pasteur, Vetrino molato, vaschetta per colorazione, microscopio ottico con obiettivo ad immersione OIL (LINK PER L’ACQUISTO).

Reagenti

Miscela alcool etilico ed etere etilico al 50%, colorante di May Grunwald, colorante di Giemsa, acqua distillata.

Principio del metodo

Per poter effettuare un esame morfologico del sangue è necessario dover allestire uno striscio ematico su di un vetrino porta-oggetti. Fissare le cellule e colorarle con il metodo May Grunwald-Giemsa. In seguito si osserva il preparato al microscopio ottico e, seguendo una procedura di seguito illustrata, si contano le varie cellule bianche esprimendo il valore in percentuale (formula leucocitaria). I corpi figurati del sangue sono: le emazie, i globuli bianchi (suddivisi in granulociti e agranulociti in base alla presenza o meno nel citoplasma di granuli), piastrine ed eventuali cellule anomale. Tra gli agranulociti troviamo i Linfociti e i Monociti, mentre i granulociti si distinguono in: Neutrofili, Basofili ed Eosinofili. Questi ultimi si differenziano per il diverso colore che presentano i granuli citoplasmatici dopo la colorazione di May Grunwald-Giemsa.

Procedimento

 Preparazione di uno striscio

1. Porre una goccia di sangue all’estremità di un vetrino porta-oggetti, ben sgrassato, con una pipetta Pasteur cercando di evitare la formazione di bolle d’aria;
2. Utilizzando un vetrino con le estremità molate, distribuire la goccia lungo il margine interno del vetrino molato;
3. Lasciar scorrere il vetrino molato lungo il vetrino porta-oggetti mantenendo una inclinazione di 45º ed una velocità costante;
4. Asciugare all’aria.

Per ottenere un’ottimo striscio sanguigno, il vetrino porta-oggetti deve essere perfettamente pulito con un buon detergente e sgrassato con una miscela di etanolo ed etere etilico al 50%. E’ importante, inoltre che lo striscio non sia nè troppo spesso nè troppo sottile, poichè nel primo caso si avrebbe un ammassamento delle cellule ematiche che renderebbe impossibile l’esame dei loro caratteri morfologici; nel secondo caso l’elevata dispersione dei globuli bianchi  causerebbe difficoltà per la determinazione della formula leucocitaria.

Effettuata la preparazione dello striscio si passa alla colorazione di May Grunwald-Giemsa.

Colorazione

Il colorante di May Grunwald è una soluzione di eosina e blu di metilene in metanolo; il primo comporterà una colorazione rosa/rossa e il secondo comporterà una colorazione blu/viola. Il Giemsa invece è una miscela di due coloranti: eosina e blu di metilene. La colorazione deve essere effettuata sotto cappa aspirante con carboni attivi.

1. Con una pipetta Pasteur coprire il vetrino con il primo colorante (May Grunwald) contandone le gocce e lasciare agire per 3 minuti; in questo fase avviene solo la fissazione delle cellule grazie alla presenza di metanolo nel reattivo;
2. Senza togliere il primo colorante aggiungere tante gocce di acqua distillata quante ne sono state messe per il primo ottenendo così una diluizione del 50%, miscelare soffiando con la pipetta; in questa seconda fase avviene la colorazione grazie al fatto che l’acqua ha permesso la dissociazione in ioni del colorante May Grunwald. Passati 3 minuti si scola, senza lavare, il colorante rimasto;
3. Si ricopre il vetrino porta-oggetti con il secondo colorante  (Giemsa) diluito con acqua distillata 1:10 e si attende 15 minuti; questo serve per la differenziazione delle cellule;
4. Lavare con acqua e lasciare asciugare.

Il vetrino così preparato potrà essere osservato al microscopio ottico con l’obiettivo ad immersione.

Come si presentano le cellule dopo la colorazione

La colorazione si basa su che tipo di reazione, (acida o basica), avranno i vari costituenti cellulari nei confronti del coloranti usati. L’eosina (acida), si fisserà sulle strutture basiche colorandosi in rosso/arancio, mentre le altre componenti acide fisseranno i prodotti di ossidazione del blu di metilene colorandosi in blu.

Quindi, gli eritrociti si presenteranno con una colorazione viola chiaro. I granulociti neutrofili avranno il nucleo blu/viola e i granuli incolori, i basofili con i granuli blu tali da ricoprire quasi completamente il nucleo e gli eosinofili con i granuli di colore rosso/arancio.

Esame morfologico ( formula leucocitaria )

L’osservazione dello striscio sanguigno colorato ci permette di determinare la formula leucocitaria, la forma dei globuli rossi e riconoscere eventuali cellule anomale.

La formula leucocitaria consiste nel determinare la percentuale dei diversi tipi di globuli bianchi nel sangue e cioè: linfociti, monociti, granulociti neutrofili, basofili ed eosinofili. A tal scopo, si sposta il tavolino del microscopio, su cui è posizionato il vetrino porta-oggetti con lo striscio sanguigno colorato, in modo da seguire l’andamento di una linea greca per osservare le varie zone del preparato.

Lungo il cammino ottico, ogni volta che s’incontra una cellula, si dovrà riconoscere a quale classe appartiene in base alla colorazione assunta e contarle fino ad un massimo di 100 cellule. Si annota, per evitare errori, con un sistema pratico consistente nel segnare punti e linee che, per ogni dieci elementi, si disegna un quadrato con due diagonali, come nell’esempio:

I valori normali sono i seguenti:

Monociti                                     4-8     %

Linfociti                                  20-40     %

Granulociti neutrofili              50-60     %

Granulociti eosinofili                 2-5     %

Granulociti basofili                    1-2    %

ATTENZIONE: Il sangue umano non può essere utilizzato nei laboratori scolastici per motivi di rischi di contaminazione; al suo posto può essere impiegato sangue di montone testato e controllato dalle ditte venditrici per addestrarsi ad eseguire lo striscio sanguigno e la colorazione di May Grunwald-Giemsa. Per la lettura e la determinazione della formula leucocitaria si possono utilizzare vetrini di strisci di sangue già preparati e pronti all’uso acquistati da ditte fornitrici specializzate in quanto il sangue di montone non presenta le caratteristiche cellulari simili a quelle del sangue umano. Si raccomanda, inoltre, di lavorare sempre sotto cappa aspirante a carboni attivi e di utilizzare i dispositivi di protezione individuale previsti dalla normativa vigente.