ESTRAZIONE DEL DNA

Potrebbe sembrare strano che in un laboratorio scolastico si possa fare un’esperienza sull’estrazione del DNA; la famosa molecola della vita “acido desossiribonucleico” che permise ai loro scopritori, Watson e Crick, di aggiudicarsi l’ambito premio Nobel nel 1962.

Eppure la tecnica non è molto complicata ed è possibile eseguirla in un paio d’ore utilizzando semplici strumenti e reagenti presenti in un comune laboratorio di scienze. Nella seguente esercitazione vedremo come può essere estratto il DNA addirittura dalle cellule di alcune fragole, ma è possibile usare anche altri frutti.

Principio del metodo

Il DNA è contenuto nel nucleo presente all’interno delle cellule vegetali eucariotiche della frutta impiegate nell’esperimento.

Per estrarlo bisogna demolire la membrana nucleare, la membrana plasmatica e la parete cellulare. Essendo le prime due essenzialmente composte da sostanze grasse (fosfolipidi), l’impiego di saponi risulta fondamentale per la loro disgregazione.

Si userà anche una soluzione di cloruro di sodio per facilitare l’eliminazione delle proteine su cui è avvolto il DNA (gli istoni). Quest’ultima operazione può essere effettuata, con migliori risultati, utilizzando del succo di ananas che contiene un enzima proteolitico, la bromelina, capace di demolire le proteine istoniche.

La procedura inziale da compiere però è quella di frammentare il frutto in modo da separare il più possibile le cellule fra loro per esporle all’azione del detersivo. Questa operazione può essere effettuata meccanicamente semplicemente tritando le fragole con una spatola o con una bacchetta di vetro (sarebbe meglio un omogenizzatore potter o simile LINK PER L’ACQUISTO). Si mescola, in seguito, del detersivo liquido alla poltiglia del frutto e si scalda a 60°C per 15 minuti per accelerare e favorire il processo di demolizione delle membrane cellulari e nucleari, oltre che per disattivare certi enzimi, (come esempio la DNAsi), che potrebbero spezzettare la molecola della vita. La permanenza a quella temperatura per molto tempo può determinare la frammentazione e la degradazione del DNA stesso ed è importante, quindi, raffreddare a bagno maria con del ghiaccio la poltiglia di fragole per qualche minuto. Si filtra il tutto in modo da eliminare il più possibile i residui cellulari e con il filtrato raffreddato si fa precipitare il DNA con dell’alcool etilico a bassa temperatura. A questo punto è possibile addirittura osservarlo al microscopio ottico ed usarlo anche per altri esperimenti.

ESTRAZIONE DEL DNA

Obiettivo

Estrarre ed osservare i filamenti di DNA dalle cellule di un campione di fragole.

Materiale

• Bagno maria termostatato; LINK PER L’ACQUISTO;
• Beuta da 100 ml;
• Becher da 500 mL;
• Becher da 100 mL;
• Cilindro graduato da 100 mL;
• Siringa da 10 mL;
• Piastra termica;
• Spatola;
• Mortaio e pestello  LINK PER L’ACQUISTO;
• Cilindro da 50ml;
• Bacchetta di vetro.

Reagenti

• Etanolo 96%;
• Una decina di fragole;
• Detersivo liquido con tensioattivi ionici;
• Sodio cloruro;
• Acqua distillata;

Valutazione rischi

In questa particolare esperienza non vi sono particolari rischi tranne che per l’uso delle piastre riscaldanti che dovranno essere utilizzate con cautela. Obbligario è comunque l’impiego dei Dispositivi di Protezione Individuali.

Procedimento

Preparazione della soluzione di estrazione:

• Prima di procedere lasciare in congelatore una ranvier con etanolo al 96% per circa 30 minuti;
• Misurare 100 mL di acqua distillata con un cilindro;
• Versare 80 mL di acqua distillata in una beuta da 100 mL e scioglierci 3g di NaCl;
• Aggiungere alla soluzione ottenuta, 10 mL  di sapone liquido con una siringa;
• Portare a 100 mL con l’acqua distillata residua del cilindro;
• Mescolare delicatamente per omogeneizzare la soluzione evitando di produrre schiuma;

Preparazione della poltiglia di fragole:

• In un  becher da 500 mL tritare 100 g di fragole (ne andranno 8 o 9 a seconda delle dimensioni) ripulite dalle foglioline, con l’aiuto di una spatola o di un mortaio, fino ad ottenere una poltiglia;

  

  

  

  Estrazione del DNA

• Versare il contenuto del primo becher (soluzione di estrazione) nella poltiglia di fragole, presenti nell’altro becher, in modo da formare una sospensione di fragole trite;

  

• Agitare, con una bachetta di vetro, per circa 2 minuti senza creare schiuma;
• Mettere a bagno maria termostatata a 60°C la sospensione di fragole trite per circa 15 minuti, agitando continuamente con la bacchetta di vetro. Se non si ha disponibile un termostato, si può preparare un recipiente contenente acqua calda a 60°C e un termometro, immergere il becher con la sospensione di fragole trite e mantenere costante la temperatura, aggiungendo, quando è necessario, acqua bollente poco alla volta;

  

• Trascorsi i 15 minuti, raffreddare il fitrato tenedolo a bagno maria con del ghiaccio per circa 5 minuti;
• Filtrare, con un colino a maglie fitte o con carta da filtro, la sospensione di fragole trite e recuperare il filtrato in un altro becher da 100 mL;

  

• (Opzionale), a 5 mL di soluzione filtrata, aggiungere 1 mL di succo di ananas ed agitare per circa 2-3 minuti per dare modo alla bromelina di agire;
• Aggiungere lentamente al filtrato di fragole (ricco di DNA), qualche mL (due pipettate) di etanolo al 60% freddo, in modo da farlo scendere lungo le pareti interne del becher;

  

• Dopo qualche minuto si noterà, sulla superficie del liquido, la formazione di un groviglio di filamenti di DNA.

  

  

Osservazioni

La metodica per estrarre il DNA è abbastanza semplice e le varie operazioni da eseguire permettono di comprendere meglio quale sia la complessa organizzazione cellulare che la natura offre per proteggere tutte le informazioni genetiche contenute nella molecola di DNA. La scelta di determinati reagenti e di particolari trattamenti, come ad esempio l’uso del sapone liquido, del sodio cloruro e dell’etanolo, nonchè dell’azione meccanica di disgregamento della poltiglia di fragole, ci obbligano ad approfondire l’aspetto teorico fino a cogliere i concetti base della biologia cellulare.