PROTEINE TOTALI NEL SANGUE

Nel plasma sono contenute svariate proteine di massa molecolare e con importanti funzioni biologiche molto diverse. Si pensi ad esempio agli ormoni, agli enzimi, alle immunoglobuline, ai fattori della coagulazione e della fibrinolisi ecc.. Le proteine plasmatiche sono sintetizzate a livello epatico ad eccezione delle Immunoglobuline, degli ormoni e di alcuni enzimi. Le condizioni che possono influenzare i livelli delle proteine sono tante (stato di nutrizione, disidratazione, disfunzioni renali o epatiche). Valori troppo alti o bassi possono essere indice di una patologia o comunque un campanello d’allarme. I valori “normali” di riferimento delle proteine totali sono compresi tra i 6 e 8 grammi per decilitro e si possono determinare attraverso un’analisi del sangue specifica. Il dosaggio delle proteine plasmatiche può essere impiegato nella diagnosi e nel monitoraggio dei malati neoplastici, negli stati di ridotto assorbimento (es. sindrome da malassorbimento), negli stati di perdita (es sindrome nefrosica, enteropatie protidodisperdenti, versamenti pleurici ed ascite) negli stati di ridotta sintesi (es epatopatie acute e croniche), nei disturbi immunologici, nelle malattie nutrizionali.

 Pincipio del metodo

La determinazione delle sieroproteine è effettuata utilizzando un metodo chimico che sfrutta la reazione del Biureto. Questo è un ammide dell’acido allofanico (NH₂CONHCOOH) e si ottiene per condensazione, a 180°C, di due molecole di urea con l’eliminazione di una molecola di NH₃.

Il BIURETO è una sostanza che può formare con il rame un complesso di colore violetto. Questa reazione non è specifica, ma avviene anche con qualsiasi composto contenente almeno due gruppi CONH₂, CH₂NH₂ o CSNH₂ e quindi possiamo sfruttarla per l’individuazione delle proteine. Per stabilizzare i sali di Cu, Weichselbaum (1950) propose un reattivo contenente tartrato di sodio e potassio e ioduro di potassio (sale di Seignette) per impedirne l’autoriduzione. L’intensità del colore sviluppato dalla reazione è proporzionale alla concentrazione delle proteine ed è quindi possibile effettuare una determinazione quantitativa con un metodo colorimetrico.

Materiale e strumentazione

• Spettrofotometro; (LINK PER L’ACQUISTO)
• Provette in vetro da 10X100 mm;
• Micropipette da 20 µl;
• Pipette graduate 1 ml;
• acqua distillata.

Composizione reagente

Esistono in commercio diversi Kit colorimetrici basati sulla reazione del biureto, con reagenti pronti all’uso e standardizzati. Comunque è possibile prepararlo, a partire dalle componenti, nel seguente modo:

In un pallone tarato da 500ml sciogliere prima 4,5g di sale di Seignette (tartrato di sodio e potassio) in 250ml di NaOH 0,2M e poi nella stessa soluzione 1,5g di CuSO₄•5H₂O. Quando tutto si è sciolto completamente aggiungere 2,5g di KI e portare a volume con acqua distillata. Il reattivo è stabile per qualche giorno a temperatura ambiente. Se preparato a 3X (tre volte concentrato), potrà essere utilizzato entro 2-3 mesi a temperatura di frigorifero.

Per lo standard usare albumina bovina alla concentrazione di 7,0 g/dl.

Campione da analizzare

Utilizzare un siero fresco non emolisato o plasma con eparina od EDTA. Si raccomanda l’uso di sieri sintetici per le analisi effettuate dagli alunni delle scuole come ad esempio una soluzione di acqua e peptone.

Precauzioni

Ogni qualvolta si manipolano agenti infettanti, reagenti chimici, reagenti di origine umana od animale, sangue o altri liquidi biologici, è consigliabile seguire le più comuni raccomandazioni e prendere tutte le necessarie precauzioni igieniche come l’utilizzazione di guanti monouso e mascherine. Si ricorda che nei laboratori degli istituti scolastici non è possibile utilizzare liquidi di origine umana ma solo quelli di origine animale resi innocui e certificati dalle ditte produttrici per l’assenza di agenti infettanti. Nei casi di addestramento professionale con studenti privi di esperienza, è opportuno utilizzare sieri sintetici innocui come ad esempio peptone disperso in soluzione fisiologica alla concentrazione voluta.

Procedimento

 Distribuire nelle provette come riportato nello schema:

	Provetta Bianco	Provetta Campione	Provetta Standard
Acqua distillata	100μl	—	—
Campione	—	100μl	—
Standard	—	—	100μl
Reagente	1ml	1ml	1ml

 N.B.: è possibile variare i volumi purchè non se ne alteri il rapporto. Miscelare ed incubare 10 minuti a temperatura ambiente. Alla lunghezza d’onda di 540 nm, azzerare lo spettrofotometro con il bianco e leggere le D.O. dello standard e del campione.

Calcolo

\( Proteine Totali (g/dl) = frac{D.O. Campione}{D.O. Standard}ast Concentrazione Standard” \)

Valori di riferimento

6,0 – 8,0 g/dl nel plasma umano, (fonte F. Pasquinelli: Diagnostica e Tecniche di Laboratorio; Parte prima, p. 666 del 1979). Questi valori dovrebbero essere utilizzati solo come linea guida ed è consigliabile che ciascun laboratorio determini i propri valori di riferimento.

Prestazioni

• Linearità: la reazione è lineare fino a 10 g/dl. Per valori superiori diluire il campione 1:2 con acqua distillata, rieseguire il test, ricalcolare il risultato e moltiplicare quest’ultimo per 2.
• Sensibilità: Valori inferiori a 0,3 g/dl non garantiscono l’attendibilità dei risultati.
• Interferenze: l’emoglobina non interferisce fino a 50 mg/dl e la bilirubina non interferisce fino a 20 mg/dl.