OBIETTIVO:
Determinazione quantitativa del glucosio, in un campione, con il metodo enzimatico colorimetrico.
INTRODUZIONE
La misura della concentrazione del glucosio nel siero o nel plasma è utilizzata per la diagnosi ed il monitoraggio del diabete (valori aumentati) e comunque per rilevare eventuali variazioni della concentrazione ematica di glucosio, sia in caso di aumentate concentrazioni, (iperglicemia), che di basse concentrazioni, (ipoglicemia). Importante è anche monitorare le variazioni e l’andamento dei livelli di glucosio nel tempo, al fine di determinare l’efficacia del trattamento terapeutico nella gestione del diabete.
Valori aumentati si hanno anche in alcuni casi di disturbi ormonali e metabolici (ipertiroidismo, ipersurrenalismo, acromegalia, etc.). Altre applicazioni sono la ricerca dell’ipoglicemia neonatale. Valori diminuiti si hanno nei tumori pancreatici (insulinomi) e negli stati di insufficienza surrenale o ipofisaria.
PRINCIPIO
Il D-glucosio viene ossidato dalla (GOD) Glucosio-ossidasi, in D-gluconolattone con formazione di perossido di idrogeno (H2O2), che per catalisi della perossidasi (POD), ossida il sistema cromogeno costituito da acido p-idrossibenzoico e 4-amminoantipirina, (reazione di Trinder), con formazione di un complesso chinonico colorato (Quinoneimine). L’intensità del colore è direttamente proporzionale al quantitativo di D- glucosio presente nel campione.
Glucosio + O2 + GOD → D-gluconolattone + H2O2
2 H2O2 + 4-Aminoantipirine + fenolo POD → Quinoneimine (complesso colorato) + 4 H2O
METODO
Test enzimatico colorimetrico GOD-PAP.
COMPONENTI DEL KIT
Per uso diagnostico in vitro.
I componenti del kit, in confezione integra e conservati in frigo a 2-8°C, rimangono stabili fino alla data di scadenza riportata sull’etichetta. Conservare al riparo della luce diretta.
REAGENTI UTILIZZATI:
- Reagente A costituito da:
– 5×20 ml Tampone fosfato pH 7.4 13.8 mM;
-Glucosio ossidasi > 10 U/ml;
-Ac. P-idrossibenzoico 39.5 mM;
-Perossidasi >700 U/l;
-4-Aminoantipirina 0.8 mM;
-Stabilizzanti e conservanti, Sodio Azide <0,1%. - Acqua distillata;
- Standard di glucosio alla concentrazione di 100 mg/dl pronto all’uso.
STABILITA’
Il Reagente (A) cromogeno è pronto per l’uso. Presenta una lieve colorazione rosata, omogenea. Tale reagente, una volta aperto, va conservato in frigo a 2-8°C e rimane stabile circa 6 mesi.
Conservato a temperatura ambiente rimane stabile 15 gg. al riparo dalla luce diretta.
MATERIALE
- Provette di vetro 10×100;
- Cuvette per spettrofotometro;
- Termostato a 37°C;
- Puntali per micro-pipette;
- Micro-Pipette a vario volume (0,1-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl, 1000-5000 µl); LINK PER L’ACQUISTO
- Spettrofotometro o fotometro da Laboratorio. LINK PER L’ACQUISTO
CAMPIONE
Siero. Raccogliere il campione di sangue in provette pulite ed asciutte e lasciare coagulare a temperatura ambiente. Il siero deve essere separato dal coagulo nel più breve tempo possibile (entro 20 minuti). Se tale termine viene superato è necessario aggiungere sostanze antiglicofermentative, quali il fluoruro di sodio o di potassio. La stabilità dopo addizione dell’inibitore glicolitico (NaF, KF) è di circa 1 giorno a 20–25 °C o 7 giorni a 4–8 °C.
Urine. Per l’esame della glicosuria utilizzare le urine delle 24 ore conservate al freddo. Il Glucosio del Sangue passa nelle Urine, normalmente, a concentrazioni superiori a 180 mg/L (soglia renale – Diabete Mellito) oppure quando si ha un abbassamento della soglia renale ( Diabete Renale).
Ovviamente, siccome non è possibile utilizzare campioni di origine biologica in un laboratorio scolastico, si potranno allestire delle soluzioni di glucosio, a varie concentrazioni, per essere utilizzate come “siero sintetico”.
PROCEDIMENTO:
- Versare, con una micropipetta da 20 µl, 20 µl di acqua distillata nella provetta siglata B (Bianco);
- Versare 20 µl di campione nella provetta siglata C;
- Versare 20 µl di soluzione standard di glucosio nella provetta siglata S;
- Aggiungere a tutte le provette 2 ml di reagente A, utilizzando una micro-pipetta da 2000 µl;
- Mescolare bene ed incubare 10 minuti a 37°C, o 20 minuti a temperatura ambiente;
- Leggere allo spettrofotometro contro Bianco, impostando la lunghezza d’onda a 500 nm, l’assorbanza dello Standard (As) e del Campione (Ac);
- Il colore rimane stabile per 60 minuti a temperatura ambiente.
CALCOLO:
As : Cs = Ac : Cc
Cc (mg/dl) = Cs • Ac ⁄ As
- As = Assorbimento dello Standard;
- Cs = Concentrazione in mg/dl di glucosio nello Standard;
- Ac = Assorbimento del Campione;
- Cc = Concentrazione in mg/dl di glucosio nel Campione di siero o urina.
NOTE
La reazione è lineare fino a 400 mg/dl di glucosio e passa attraverso lo zero. Per valori superiori a 400 mg/dl, o in caso di sieri fortemente lipemici, diluire 1:2 il campione con soluzione fisiologica e moltiplicare i valori ottenuti per 2.
VALORI NORMALI
Siero-Plasma: 65-110 mg/dl. Si consiglia a ciascun laboratorio di determinare i propri valori di riferimento.
PRECAUZIONI
Usare i dispositivi di protezione individuali come il camice, guanti in lattice, occhialetti di protezione. Lavorare utilizzando una cappa aspirante e svolgere l’attività in presenza di personale qualificato.
Il reagente A contiene sodio azide come conservante (0.1 %). Non ingerire! Evitare il contatto con la pelle e le mucose. In caso di spargimento accidentale diluire con acqua.
Tali prodotti sono solo per uso professionale e vanno utilizzati da personale qualificato.
SENSIBILITA’
Il kit determina una concentrazione minima di 2 mg/dl di Glucosio nel siero.
