PCR, REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

LA VARIABILITÀ DEL GENOMA UMANO PERMETTE LA CREAZIONE DI IMPRONTE GENETICHE

Il genoma umano è identico al 99,9% tra gli individui. Tuttavia, esistono delle regioni di variazione all’interno del nostro genoma (lo 0,1% restante) chiamate polimorfismi, che vengono ereditati dai genitori. Basandosi su diverse regioni polimorfiche è possibile scoprire l’impronta genetica” di una persona che, proprio come una normale impronta digitale, ci permette tra l’altro di identificare e distinguere gli individui. Poiché i polimorfismi sono ereditari, l’impronta genetica è ampiamente utilizzata in vari campi, come l’analisi ambientale e agroalimentare, per testare lo stato del territorio e degli alimenti, o la diagnostica molecolare, per la diagnosi di malattie ereditarie o per determinare i rapporti di parentela.

L’impronta genetica trova largo spazio soprattutto nelle scienze forensi, perché permette di abbinare i sospetti alle scene del crimine. Questo metodo, sviluppatosi ulteriormente nel corso degli anni, fu impiegato per la prima volta da Sir Alex Jeffreys nel 1984 presso l’Università di Leicester, in Inghilterra. Alcuni iniziali successi della sua metodica furono Richard Buckland, che nel 1986 venne assolto dalle accuse di omicidio, e Colin Pitchfork, che nel 1987 fu il primo criminale ad essere catturato e condannato utilizzando l’impronta genetica.

L’obiettivo dell’impronta genetica è analizzare il campione genetico in modo da evidenziarne le piccole differenze nel DNA di persone diverse. Agli albori, l’analisi dell’impronta genetica era accurata, ma richiedeva una notevole quantità di materiale di partenza. Essa prevedeva l’utilizzo di polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione i quali, una volta aggiunti al campione, riconoscono e tagliano il DNA in specifiche sequenze nucleotidiche, creando frammenti di varia lunghezza. Queste differenze vengono visualizzate attraverso l’elettroforesi su gel.

Oggi si utilizza una tecnica più avanzata, che permette di rilevare le impronte digitali partendo anche da una quantità molto piccola di campione di DNA. Gli individui possiedono all’interno del loro DNA delle regioni non codificanti e che contengono unità ripetitive di nucleotidi. Questi sono chiamati VNTR (numero variabile di ripetizioni tandem) se sono lunghe da 15 a 70 bp e STR (ripetizioni tandem brevi) se sono lunghe da 2 a 6 bp. Entrambe le sequenze possono ripetersi ovunque da tre a cento volte, formando alleli di dimensioni e lunghezze specifiche. Un esempio di STR è D7S820, situato sul cromosoma 7, contiene tra 5 e 16 ripetizioni di “GATA”. L’uomo presenta due copie di questo locus genetico, uno proveniente dalla madre e l’altro dal padre, e quindi possiede due alleli in questo sito: se entrambi gli alleli sono uguali l’individuo è omozigote, se sono diversi è eterozigote per D7S820. Questo locus può avere lunghezze diverse, quindi possono verificarsi centinaia di combinazioni alleliche diverse.

Si può sfruttare la potenza della STR osservandone la presenza di più loci simultaneamente. Tredici loci indipendenti sono stati stabiliti come standard per l’identificazione umana: CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 e D21S11. La probabilità di trovare tutti i 13 loci durante un’analisi è 1 su 3 trilioni. Il CODIS (Combined DNA Index System), è un database istituito dall’FBI (Federal Bureau of Investigation) nel 1990 ed è basato proprio su questi 13 loci. Esso è un sistema di database che consente il confronto del DNA della scena del crimine con i profili del DNA di un colpevole condannato e un indice forense (scena del crimine). Se il DNA della scena del crimine corrisponde a quello di uno nell’indice dei condannati, esso è un sospettato per il crimine, mentre se corrisponde ad un indice seriale diverso, indica un delinquente seriale.

 

 

CREARE UN’IMPRONTA GENETICA DA UN REATO

Per creare l’impronta genetica si comincia con la raccolta legale di prove biologiche dalla scena del crimine o dalla vittima. Il campione viene trattato con un detergente per lisare (rompere) le membrane cellulari ed estrarre il DNA, per realizzare l’impronta e sottoporla ad ulteriori analisi. L’eventuale corrispondenza con l’impronta genetica di uno dei vari sospettati fornisce la prova evidente della presenza del sospettato sulla scena del crimine.

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

Negli odierni laboratori forensi, il modo più veloce ed efficace per realizzare un’impronta genetica è la PCR (Polymerase Chain Reaction). La PCR è un sistema automatizzato per isolare e amplificare il DNA in provetta, basato sulla capacità dell’enzima DNA polimerasi di sintetizzare un nuovo filamento di DNA a partire da un filamento stampo.

In questo modo è possibile isolare e studiare un qualsiasi tratto di DNA a partire da un campione biologico in cui è presente in copie esigue; questo rappresenta il vantaggio principale della PCR. Attraverso tale reazione, a partire da una singola molecola di DNA che fa da stampo, si possono generare miliardi di frammenti identici dello stesso in poche ore. Tale metodica fu ideata nel 1983 dallo scienziato statunitense Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il Premio Nobel per la chimica nel 1993. La possibilità di disporre di grandi quantità del DNA di interesse è stata fondamentale per la nascita delle biotecnologie e delle scienze forensi.

La PCR ricostruisce in vitro quello che si verifica nel nucleo cellulare durante la replicazione del DNA. Partendo da una singola copia di una sequenza di DNA e facendola reagire con la DNA polimerasi, dopo un ciclo di reazione si otterranno due copie identiche tra loro e a quella di partenza. Se la reazione viene ripetuta per n cicli, alla fine si otterranno 2n copie della molecola di partenza. Una differenza importante tra PCR e replicazione è che nella PCR viene amplificata una piccola sezione del genoma (come dettato dai primer) anziché l’intero genoma.

Poiché la PCR avviene in microprovette da 200 µl, gli scienziati devono fornire alcuni ingredienti chiave:

• il DNA stampo da amplificare.
• l’enzima Taq polimerasi, una Dna polimerasi ottenuta dal batterio termoresistente Thermus aquaticus che vive in sorgenti idrotermali: questo enzima, a differenza di quello umano, è capace di rimanere attivo anche alle alte temperature necessarie per la denaturazione.
• una coppia di oligonucleotidi (brevi sequenze di DNA) detti primer, che funzionano da inneschi per la Taq polimerasi.
• i quattro nucelotidi trifosfato.
• un Buffer che serve a mantenere il pH stabile (tampone) e necessario per
  costituire l’ambiente adatto alla reazione.

L’intera procedura è assai rapida poiché ciascun ciclo dura solo pochi minuti, e per essere realizzata si utilizza un termociclatore, uno strumento in grado di programmare nel tempo, in modo automatico, la temperatura. Una reazione di PCR avviene all’interno di microprovette contenenti i reagenti, che vengono poste all’interno del termociclatore. La reazione della PCR si svolge in tre tappe.

1. Denaturazione: dato che la DNA polimerasi utilizza uno stampo a singolo filamento, la miscela viene scaldata alla temperatura di 95 °C per permettere la rottura dei legami a idrogeno tra i due filamenti di DNA.
2. Appaiamento o Annealing (ricottura): la temperatura viene abbassata a 50-60 °C e i primer possono appaiarsi alle sequenze complementari sui due filamenti.
3. Allungamento o Estensione: la temperatura viene nuovamente alzata fino a 68-72 °C, valore ottimale per la Taq polimerasi che inizia a sintetizzare la prima copia della porzione di DNA compresa tra i due primer.

Questi tre passaggi (denaturazione, annealing ed estensione) costituiscono un ciclo di PCR. Terminata la fase di allungamento, il ciclo si ripete per circa 30 volte ricominciando dalla fase di denaturazione. Alla fine di tutto il processo si avranno 230= 1 073 741 824 copie partendo da una sola copia del DNA di partenza.

ELETTROFORESI SU GEL

Alla fine dei 30 cicli all’interno del termociclatore, i prodotti della PCR vengono visualizzati mediante elettroforesi su gel. In questa metodica il prodotto amplificato viene aggiunto in delle depressioni (chiamate “pozzetti”) all’interno di un gel di agarosio, attraverso il quale viene fatta passare una corrente elettrica. Per favorire il passaggio della corrente, all’interno dell’apparecchio per elettroforesi si aggiunge un tampone; in questo esperimento è stato utilizzato il tampone TAE.

Ma cos’è l’agarosio? L’agarosio è un polisaccaride lineare formato da unità di D-galattosio e di 3,6-anidro-L-galattosio legate alternativamente con legami glicosidici. L’agarosio è uno zucchero solubile in acqua quando è portato a temperatura di ebollizione; per questo, durante la sua preparazione, esso deve essere riscaldato e accuratamente mescolato con l’acqua distillata (assieme ad altri reagenti) così da sciogliersi completamente. Man mano che si raffredda, esso diventa solido e forma una matrice attraverso dei legami a idrogeno tra le catene lineari. Oltre all’agarosio, per l’elettroforesi vengono impiegati anche altri gel, come ad esempio l’agar, l’amido o miscele di agarosio e poliacrillamide (quest’ultimo consente una più fine separazione delle molecole).

Poiché la struttura del DNA ha una carica negativa, dovuta alla presenza dei gruppi fosfato, la corrente spinge il DNA attraverso il gel dall’elettrodo negativo verso quello positivo. A livello molecolare, il gel funziona da “setaccio molecolare” poiché contiene piccoli canali attraverso cui può passare il DNA: i piccoli frammenti si muovono facilmente attraverso l’agarosio rispetto a quelli grandi e ciò dipende dal peso molecolare. Poiché le molecole di dimensioni diverse viaggiano a velocità diverse, esse si separano a formare delle “bande” all’interno del gel.

Dopo aver interrotto la corrente e aver lasciato migrare le molecole per circa 1 ora, le bande possono essere visualizzate utilizzando un colorante che si lega al DNA. In genere, l’analisi delle proteine mediante elettroforesi richiede tempi più lunghi rispetto al DNA. Nel caso in cui non si disponga del colorante, è possibile utilizzare una lampada a raggi UV detta transilluminatore a LED. Infine, la lunghezza dei loci viene calcolata confrontando la distanza percorsa dalla banda rispetto a una scala di DNA comprendente diverse lunghezze note. Nell’analisi forense tutto il procedimento viene ripetuto per diversi loci.

 

OBIETTIVO

In questo esperimento, studenti e insegnanti progetteranno la propria scena del crimine riproducendo tutti i passaggi di una vera e propria indagine forense, utilizzando la PCR e l’elettroforesi su gel di agarosio. Le impronte genetiche saranno rivelate su campioni simulati provenienti da una finta scena del crimine e saranno presenti quattro sospettati. Le regioni polimorfiche del DNA verranno amplificate dagli studenti con la PCR e poi analizzate mediante elettroforesi. L’esperienza, che sarà svolta mediante il kit Edvotek, sarà divisa nei seguenti moduli:

1. Modulo I (70 min): amplificazione con PCR della scena del crimine;

2. Modulo II (50-70 min): separazione dei prodotti della PCR mediante elettroforesi;

3. Modulo III (10-30 min): visualizzazione delle bande sul transilluminatore;

4. Modulo IV (opzionale, 10-30 min): colorazione con Flashblue.

NOTA: i tempi sperimentali sono approssimativi.

COMPONENTI DEL KIT

Reagenti (conservazione a -20°C):

• Comp. A Miscela LyphoPrimer (giallo)

• Comp. B Scala da 200 bp del DNA Edvoquick (viola)

• Modello di DNA della scena del crimine (CS)

• Comp. C Modello di DNA n.1 (rosso)

• Comp. D Modello di DNA n.2 (rosso)

• Comp. E Modello di DNA n.3 (rosso)

• Comp. F Modello di DNA n.4 (rosso)

• Comp. G Tampone TAE concentrato 50x (arancio, per elettroforesi)

Reagenti (conservazione a temperatura ambiente):

• UltraSpec-Agarosio (agarosio in polvere)

• SYBR Safe Stain (colorante per gel di agarosio per elettroforesi)

• Colorante liquido FlashBlue (per visualizzazione delle bande nel gel)

• PCR EdvoBeads (DNA polimerasi)

NOTE: Ogni PCR EdvoBead contiene una miscela di dNTP, un tampone Taq DNA polimerasi, una Taq DNA polimerasi, MgCl e un tampone di reazione.

Reagenti (non inclusi nel kit):

• Acqua distillata

Materiali e strumenti (compresi nel kit):

• Provette per microcentrifuga

• Provette per PCR da 0,2 mL (200µL)

• Termociclatore

• Alimentatore di corrente elettrica

• Microcentrifuga

• Apparecchio per elettroforesi su gel orizzontale

• Cappucci terminali in gomma (per elettroforesi)

• Transilluminatore UV o a luce blu

• Micropipette graduate (5-50 µL) con puntali da 0,2 mL (200µL)

Materiali e strumenti (non inclusi nel kit):

• Pallone, beuta o becher da 250 mL

• Guanti di protezione dal caldo

• Guanti da laboratorio monouso

• Occhiali di protezione UV

• Microonde o piastra riscaldante

• Sistema di visualizzazione a luce bianca (da usare in caso di colorazione con FlashBlue)

NOTE: Tutti gli apparecchi necessitano di una presa per funzionare. Se necessario, utilizzare un adattatore appropriato (100 o 220 V).

NOTE: Il kit contiene materiale sufficiente per eseguire 25 reazioni PCR e 5 gel. Gli studenti possono essere divisi in gruppi di cinque studenti ciascuno, potendo quindi analizzare cinque campioni per gruppo. Vi è anche abbastanza DNA modello per consentire a ciascun gruppo di eseguire uno scenario unico sulla scena del crimine forense.

NOTE: Le istruzioni QuickGuide e le linee guida dell’intero esperimento, con descrizione dei materiali e strumenti, possono essere trovate sul sito web ufficiale di Edvotek (www.edvotek.com).

SICUREZZA DI LABORATORIO

1. Indossare sempre gli strumenti di protezione individuale, come occhiali e guanti (monouso e per protezione dal calore). I guanti monouso devono essere utilizzati durante tutta la durata dell’esperimento, soprattutto con i coloranti e quando si maneggiano le apparecchiature. Per il microonde o la piastra riscaldante usare, invece, i guanti per il calore.

2. Non mettere in bocca o mettere a contatto diretto con la pelle i reagenti. Utilizzare sempre gli strumenti specifici.

3. Prestare la massima attenzione quando si lavora con le apparecchiature.

4. Lavarsi sempre accuratamente le mani con acqua e sapone dopo aver maneggiato reagenti o materiali biologici.

5. Lavorare sempre sotto la supervisione dei docenti esperti.

MODULO I: AMPLIFICAZIONE CON PCR DELLA SCENA DEL CRIMINE

Ciascun gruppo dovrebbe ricevere:

• 5 provette per PCR da 0,2 mL (200 µL)

• 5 PCR EdvoBeads (DNA polimerasi)

• Modello di DNA della scena del crimine (CS)

• 4 Modelli di DNA di ciascun sospettato

• Comp. B Scala del DNA

• Comp. A Miscela LyphoPrimer (giallo)

• Comp. G Tampone TAE concentrato 50x (arancio)

Il primo passo è preparare le provette contenenti il DNA sospetto, così da essere poi inserite nel termociclatore per eseguire con PCR l’amplificazione dei frammenti del DNA.

La PCR avviene in microprovette e quelle preferite dagli scienziati sono del tipo Eppendorf: sono facili da aprire e offrono una sigillatura ermetica per prevenire l’evaporazione durante il processo di amplificazione del DNA. Grazie alle pareti sottili e costanti e alla superficie liscia, assicurano un efficiente trasferimento del calore al campione, accelerando la PCR. Esistono diverse varianti di provette Eppendorf, tra cui quelle da 0,2 mL e 0,5 mL, con o senza tappo integrato.

I moderni termociclatori sono dotati di un coperchio riscaldato che, premendo sui tappi delle provette, impedisce la formazione di condensa nella parte superiore e quindi l’evaporazione della reazione; le provette Eppendorf garantiscono una sicurezza maggiore. Per i termociclatori che non sono dotati di questo particolare coperchio, è necessario posizionare uno strato di cera o olio minerale all’interno delle provette per prevenirne l’evaporazione.

Preparazione delle provette.

1. Etichettare 5 provette PCR, una per la scena del crimine (CS) e quattro per i sospettati (n.1, n.2, n.3, n.4). Mettere le proprie iniziali o il numero del gruppo sulle provette.

 

 

NOTA: il campione CS può anche non essere lo stesso per i diversi gruppi.

2. Per la preparazione delle provette (da 200 µL) aggiungere 20 µL di primer (di colore giallo), 5 µL di ognuno dei cinque campioni di DNA (di colore rosso) e 1 PCR EdvoBead (DNA polimerasi) in ognuna delle provette.

3. Mescolare delicatamente i campioni, assicurandosi che le EdvoBeads si siano completamente disciolte.

NOTA: ricontrollare che sia il primer sia il DNA siano stati aggiunti osservando il colore della miscela, che dovrebbe assumere una colorazione arancione.

Come impostare il termociclatore.

1. Accendere l’apparecchio.

2. Cliccare su “SAVED” per visualizzare i cicli presalvati.

3. Cliccare su “NEW” per creare una nuova cartella con i cicli personalizzati. Impostare i valori descritti al punto 2 nella sezione sottostante “Utilizzo della microcentrifuga e del termociclatore”.

4. Cliccare su “SALVA” e dare un nome a piacere al file (ad esempio “CORSO PCR”).

5. Cercare il file “CORSO PCR” tra “SAVED”.

6. Selezionare il file e premere su “AVVIO”. La zona che si illumina sul display indica la fase in cui lo strumento sta operando.

 

Utilizzo della microcentrifuga e del termociclatore.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Accendere la microcentrifuga e centrifugare i campioni per alcuni secondi, così da raccogliere il campione sul fondo delle provette. Inserire nello strumento due provette per volta e posizionarle sui lati opposti.

2. Amplificare il DNA mediante PCR: si consiglia un pre-ciclo (di circa 3-5 min) solo per il primo ciclo, per verificare che il termociclatore sia programmato correttamente. Impostare le seguenti condizioni del ciclo.

   • Denaturazione iniziale 94°C per 3 minuti (pre-ciclo)

   • 94°C per 30 secondi (x30 cicli)

   • 55°C per 65 secondi (x30 cicli)

   • 72°C per 30 secondi (x30 cicli)

   • Estensione finale 72°C per 4 minuti (post-ciclo)

3. Dopo la PCR, posizionare la provetta sul ghiaccio e procedere al modulo II.

 

 

NOTA: I campioni amplificati possono essere conservati a -20°C per l’elettroforesi in un secondo momento.

MODULO II: SEPARAZIONE DEI PRODOTTI DELLA PCR MEDIANTE ELETTROFORESI

Ciascun gruppo dovrebbe ricevere:

• Comp. G Tampone TAE concentrato 50x (arancio, per elettroforesi)

• Comp. B Scala da 200 bp del DNA (viola)

• Acqua distillata

• bacchetta di vetro

• Microonde o piastra riscaldante

• Pallone, beuta o becher da 250 mL

• UltraSpec-Agarose (agarosio in polvere)

• SYBR Safe Stain da 25 µL diluito (colorante per gel di agarosio per elettroforesi)

• Modello di DNA della scena del crimine (CS)

• Campioni PCR dal Modulo I

Il secondo passo richiede la preparazione del gel di agarosio per l’elettroforesi. Per ottenere migliori risultati, si consiglia la preparazione di gel da 7×7 cm, altrimenti si può optare per un gel 7×14 cm (le dosi dei reagenti variano in base alle dimensioni del gel). Questo esperimento richiede un gel di agarosio all’1,0% per ciascun gruppo di studenti. I gel possono essere preparati in anticipo e conservati per un uso successivo.

Preparazione del tampone.

1. Diluire 20 mL di tampone TAE concentrato 50x in un cilindro graduato da 1 L e portare a volume con acqua distillata. In questo modo otteniamo un tampone TAE 1x.

2. Mescolare con una bacchetta di vetro.

 

NOTE: Nel caso in cui si volesse utilizzare il tampone in un secondo momento, versare il tutto in un contenitore scuro, così da proteggerlo dalla luce.

Preparazione del gel di agarosio con SYBR Safe Stain.

1. Aggiungere 1,0 g di polvere di agarosio pesato in 100 mL di tampone TAE 1x in una beuta da 250 mL.

2. Sciogliere l’agarosio in polvere facendo bollire la soluzione in microonde (o su piastra riscaldante) per 1 minuto, fino a quando l’agarosio non è completamente sciolto (la soluzione deve essere limpida come l’acqua). Nel frattempo mescolare accuratamente facendo roteare la beuta.

3. Raffreddare l’agarosio a 60°C agitando attentamente la beuta per favorire una dissipazione uniforme del calore.

NOTA: In alternativa al microonde, l’agarosio può essere portato a bollore anche su una piastra riscaldante, continuando a mescolare con una bacchetta di vetro per far scogliere completamente l’agarosio. In ogni caso, quando si lavora con ciascuno dei due strumenti, utilizzare sempre i guanti di protezione termica. Per tutti gli altri passaggi sono sufficienti normali guanti monouso.

4. Mentre l’agarosio si raffredda, sigillare le estremità del vassoio di colata del gel con i cappucci terminali in gomma. Posizionare il pettine nell’apposita tacca.

5. Prima di colare il gel, aggiungere sull’agarosio raffreddato 25 µL di colorante SYBR Safe Stain diluito e agitare per miscelare.

6. Versare il composto nel vassoio. Il gel dovrebbe solidificarsi completamente entro 20 minuti, diventando sempre meno trasparente.

7. Rimuovere i cappucci terminali e il pettine. Prestare particolare attenzione quando si rimuove il pettine per evitare danni ai pozzetti.

Protocollo alternativo.

Preparata la miscela dell’agarosio, questo può essere versato nella camera di colata inserita direttamente nello strumento per elettroforesi, quindi non è necessario l’uso dei cappucci terminali in gomma.

NOTA: I gel solidificati, sia prima che dopo l’elettroforesi, possono essere conservati fino a una settimana in frigorifero in sacchetti di plastica contenenti una piccola quantità di tampone per evitare l’essiccazione. Si consiglia di aggiungere solo 2 mL di tampone alla sacca per evitare che SYBR Safe Stain diffonda nel gel. Non conservare i gel a temperature troppo basse (circa -20°C) perché il congelamento li distruggerà.

Ingredienti e dosi per la preparazione del gel di agarosio all’1,0% con SYBR Safe Stain
Dimensione del vassoio per il gel	Concentrato Buffer 50x	Acqua distillata	Agarosio	Volume totale	SYBR Safe Stain
7×7 cm	0,5 mL	24,5 mL	0,25 g	25 mL	25 µL
7×14 cm	1,0 mL	49,0 mL	0,50 g	50 mL	50 µL

Utilizzo del gel.

1. Posizionare il vassoio contenente il gel nella camera dell’elettroforesi e coprire il gel con il tampone 1x per l’elettroforesi. Il gel dovrebbe essere completamente sommerso. Ciò permetterà alla corrente elettrica di oltrepassare il gel e di far migrare correttamente i frammenti di DNA.

2. Caricare i pozzetti come indicato nella tabella seguente.

Caricamento dei pozzetti del gel con i campioni
Nome del pozzetto	Campione inserito	Quantità di campione inserito
“CS”	Campione PCR della scena del crimine (CS)	25 µL
“1”	Sospetto PCR n.1	25 µL
“2”	Sospetto PCR n.2	25 µL
“3”	Sospetto PCR n.3	25 µL
“4”	Sospetto PCR n.4	25 µL
“Scala”	Scala da 200 bp del DNA	30 µL

 

 

NOTA: Prima di caricare i campioni, assicurarsi che il gel sia orientato correttamente nella camera dell’apparecchio. Ricordarsi di utilizzare sempre i guanti e gli occhiali di sicurezza.

3. Posizionare il coperchio di sicurezza sulla camera.

4. Collegare i cavi al generatore di corrente ed eseguire l’elettroforesi. In base al voltaggio i campioni, carichi negativamente, impiegheranno tempi diversi per migrare verso l’elettrodo positivo (rosso).

5. Al termine dell’elettroforesi, rimuovere il gel e il vassoio di colata dalla camera dell’apparecchio.

Linee guida su tempo e tensione
Volt	Minimo	Massimo
150	15 min	20 min
125	20 min	35 min
70	35 min	1 ora

NOTA: si consiglia una tensione di 125 V per circa 30 minuti. Se si imposta un voltaggio troppo alto, potrebbe succede che il gel si spacchi; una tensione troppo bassa, al contrario, potrebbe rendere difficile la migrazione del DNA.

MODULO III: VISUALIZZAZIONE DELLE BANDE SUL TRANSILLUMINATORE

Ciascun gruppo dovrebbe ricevere:

• Gel di agarosio dopo elettroforesi

• Transilluminatore LED o UV

• Acqua distillata

Il nuovissimo transilluminatore LED Trublu fornito dal kit Edvotek utilizza la luce blu (lunghezza d’donda 470 nm) e la luce bianca per visualizzare i gel di DNA colorati con SYBR Safe Stain, eliminando così la necessità di luce UV o bromuro di etidio; comunque, lo strumento funziona bene anche con altri tipi di gel e coloranti. Nel caso si impiegasse un transilluminatore UV o a LED, e nonostante il coperchio arancione fornisca una protezione dalla luce blu, bisogna assicurarsi di indossare sempre gli occhiali di protezione (sono sufficienti occhiali da sole per luce a UV).

L’ampia area di visualizzazione (14,4 x 18 cm) dello strumento permette di contenere una grande quantità di agarosio, rispetto a modelli più obsoleti o funzionanti con meccanismi diversi. Inoltre, il controllo dell’intensità della luce blu e il coperchio arancione garantiscono una visualizzazione superiore. Questo contrasto di colori darà come risultato la visualizzazione di bande di colore verde brillante, ben visibili su uno sfondo scuro.

Questo transilluminatore permette la visualizzazione anche di più gel contemporaneamente. Inoltre, non è solo per l’elettroforesi. Sia l’ampia area di visualizzazione che il sistema a doppia illuminazione lo rendono ottimo per visualizzare i risultati di esperimenti di trasformazione batterica, estrazioni proteiche e una varietà di saggi colorimetrici.

Pericoli.

• Non versare liquidi all’interno del transilluminatore.

• Indossare guanti usa e getta e occhiali UV.

• Non guardare direttamente la luce blu senza il coperchio arancione.

• Le coperture arancione e blu sono resistenti ai graffi ma non a prova, quindi non avvicinare oggetti appuntiti. Se bisogna togliere il gel dalla piattaforma, utilizzare oggetti spuntati.

Come usare il transilluminatore.

 

 

1. Per un’analisi migliore, posizionare lo strumento su una superficie piana e abbastanza luminosa, come vicino a una finestra.

2. Alzare il coperchio arancione e quello blu.

3. Prima di accendere l’apparecchio, posizionare il gel sulla superficie blu di visualizzazione, per utilizzare la luce blu, oppure sulla superficie bianca, per utilizzare la luce bianca.

4. Accendere la luce bianca regolando l’interruttore sull’impostazione inferiore (cerchio bianco). Per la luce blu usare l’interruttore superiore (cerchio nero).

Visualizzazione del SYBR Gel.

1. Far scorrere il gel dal vassoio sulla superficie di visualizzazione del transilluminatore e accendere l’unità. Regolare la luminosità al livello desiderato per massimizzare la visualizzazione della banda.

2. Fotografare i risultati.

3. Una volta terminato l’esperimento, rimosso il gel e smaltito correttamente, pulire le superfici del transilluminatore con acqua distillata.

MODULO IV: COLORAZIONE CON FLASHBLUE (OPZIONALE)

Ciascun gruppo dovrebbe ricevere:

• 10 mL di FlashBlue concentrato 10x OPPURE 100 mL di FlashBlue diluito 1x

• Piccolo vassoio di plastica

• Acqua distillata o deionizzata

• Sistema di visualizzazione a luce bianca

Nel caso in cui si volesse fare un’ulteriore analisi della migrazione dei frammenti di DNA su agarosio a seguito di elettroforesi, le bande possono essere visualizzate mediante un colorante che viene aggiunto, in un secondo momento, al gel. È un passaggio facoltativo poiché, se non si dispone del colorante apposito per questa fase (FlashBlue o altri), è possibile optare per il transilluminatore.

La colorazione FlashBlue, rispetto ad altri agenti coloranti, permette di ottimizzare i tempi sia per la fase di colorazione che di decolorazione. Il gel di agarosio viene colorato con FlashBlue diluito per 5 minuti e poi decolorato per soli 20 minuti. Per ottenere risultati migliori, lasciare il gel nel colorante durante la notte. Ciò consentirà al gel colorato di “equilibrarsi” nella sostanza decolorante, producendo bande di DNA blu scuro che contrastano molto bene con uno sfondo uniformemente azzurro. Si consiglia una scatola luminosa bianca per evidenziare meglio questo contrasto.

Oltre al FlashBlue, un colorante ampiamente utilizzato è l’etidio bromuro, le cui molecole riescono ad intercalarsi tra le basi del DNA a doppio filamento, emettendo una luce fluorescente quando irradiata da luce violetta (300 nm). Altri tipi di colorazioni utilizzano sali di argento, blu cresile brillante, blu di metilene, xilene cianolo, cresolo rosso e il blu di boromofenolo.

Un colorante normalmente impiegato per elettroforesi, che ha sollevato preoccupazioni riguardo alla sua potenziale cancerogenicità, è il rosso ponceau. Esso è catalogato dall’Unione Europea come colorante alimentare in diverse bibite e dolci con la sigla E124. Invece, in altri paesi come gli Stati Uniti e la Francia ne è proibito l’utilizzo dal 2008, poiché ad esso viene associata una correlazione anche con la sindrome da deficit dell’attenzione e iperattività nell’infanzia. Tuttavia, gli organismi regolatori hanno stabilito dei limiti di sicurezza per E124, che dovrebbero garantire livelli di esposizione accettabili per i consumatori.

Protocollo classico.

1. Diluire 10 mL di colorante FlashBlue concentrato 10x (oppure diluito 1x) con 90 mL di acqua distillata o deionizzata in una beuta e mescolare bene.

2. Rimuovere il gel di agarosio dalla camera per l’elettroforesi, facendo scorrere il gel dal vassoio di colata in un altro vassoio piccolo e pulito per la colorazione del gel.

NOTE: utilizzare i guanti e gli occhiali di sicurezza, per non venire a contatto diretto con le soluzioni coloranti che potrebbero essere nocive per la pelle.

3. Coprire il gel con la soluzione colorante 1x FlashsBlue per 5 minuti. Per ottenere un migliore risultato, ci si può aiutare con un agitatore orbitale per agitare delicatamente il gel durante la decolorazione.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

NOTE: tingere il gel per più di 5 minuti richiederà un tempo di decolorazione maggiore.

4. Trascorsi i 5 minuti, trasferire il gel in un vassoio piccolo secondario e riempirlo con acqua. Decolorare per almeno 20 minuti agitando delicatamente.

NOTE: decolorare il gel per più di 20 minuti darà risultati migliori e le bande saranno meglio visibili.

5. Rimuovere attentamente il gel dal liquido decolorante e illuminare con luce bianca (ad esempio la torcia di un telefono) per osservare i risultati.

NOTE: I gel colorati possono essere conservati nel liquido decolorante per diverse settimane se refrigerati, ma bisogna tenere presente che le bande possono sbiadire con il tempo. In tal caso, ripetere la colorazione del gel. Una volta inutilizzabili, i gel colorati possono essere smaltiti tra i rifiuti solidi, mentre le soluzioni decoloranti possono essere smaltite negli scarichi.

Protocollo alternativo.

1. Diluire 1 mL di colorante FlashBlue concentrato 10x con 149 mL di acqua distillata.

2. Coprire il gel con il colorante diluito.

3. Immergere il gel nel liquido colorante per almeno 3 ore. Per risultati migliori, lasciare il gel immerso per tutta la notte.

CONCLUSIONI

Dalle osservazioni fatte si può constatare che il colpevole della scena del crimine è il campione 2 (terza corsia partendo da destra): la sua banda coincide infatti con quella del campione modello di DNA (seconda corsia partendo da sinistra). Questa è una prova evidente che il sospettato n°2 è stato presente sulla scena del crimine, ma non conferma la sua colpevolezza.

 

 

Bibliografia:

Il termociclatore e i reagenti necessari per l’esecuzione della tecnica PCR sono stati forniti dalla ditta: EVOTEK e per approfondimenti consultare il sito: https://www.edvotek.com/learning-center-pcr