Per osservare al microscopio ottico dei microrganismi è necessario disporre di un mezzo di coltura che ci permette di farli crescere e moltiplicare in modo da averne un quantitativo sufficiente. L’uso dei terreni di coltura è fondamentale per poter avere un numero molto elevato di cellule a disposizione per analizzarle, sia per l’aspetto morfologico che per l’identificazione della specie d’appartenenza, attraverso i test biochimici. In questo articolo vedremo come si prepara, in un laboratorio scolastico, un comune terreno generico.
Il terreno di coltura che impiegheremo è il Plate Count Agar, che permette la crescita di molti microrganismi tranne quelli più esigenti dal punto di vista nutrizionale, ovvero i patogeni. Questo tipo di terreno è molto simile all’Agar Nutrient, ma la sua composizione è tale da facilitare una eventuale conta delle colonie batteriche che vi possono crescere. Infatti si presenta più trasparente dell’agar nutrient e quindi sono più evidenti le colonie anche se queste sono inglobate nel terreno stesso.
La composizione del Plate Count Agar (PCA) è la seguente:
- 2,5 g di estratto di lievito;
- 5 g di triptone (digerito pancreatico di caseina);
- 1 g di destrosio;
- 15 g di Agar-agar.
- 1000 ml di acqua distillata
pH finale 7.0 ± 0.2 a 25°C
La composizione dell’Agar nutrient è:
- 5,0 g di peptone;
- 1.5 g di Estratto di lievito;
- 1,5 g di Estratto di manzo;
- 5,0 g di Cloruro di sodio;
- 15,0 g di Agar.
pH finale del Nutrient Agar, misurato a 25°C, è 7.4 ±0.2.
Il terreno PCA è costituito da vari componenti che contribuiscono alla crescita batterica.
Il digerito enzimatico della caseina funge da fonte di aminoacidi, azoto, carbonio, vitamine minerali, che forniscono nutrienti essenziali necessari per il metabolismo e la moltiplicazione batterica.
L’estratto di lievito è un altro ingrediente chiave che fornisce vitamine del complesso B, che sono importanti cofattori per molte reazioni enzimatiche coinvolte nella crescita batterica.
Il glucosio, un carboidrato fermentabile presente nel PCA, funge da fonte di energia per il metabolismo batterico. I batteri possono utilizzare il glucosio attraverso la fermentazione, producendo energia e sottoprodotti metabolici.
L’agar è agente solidificante ed è un polisaccaride estratto da alcune specie di alghe rosse, tra cui le varietà Gelidium, Gracilaria e Pterocladia. L’agar forma una matrice gelatinosa quando viene raffreddato, fornendo una superficie solida per lo sviluppo di colonie batteriche. Aiuta nell’isolamento e nella numerazione delle singole colonie.
Preparazione del terreno di coltura “Plate Count Agar (PCA)”
Obiettivo:
Preparare 100 ml di un terreno di coltura generico utile per permettere la crescita di colonie batteriche come ad esempio il Plate Count Agar (PCA).
Materiale utilizzato:
- Bilancia tecnica sensibilità: 0,01 g;
- Vetrino da orologio;
- Spatola;
- Beuta da 250 ml;
- Cilindro graduato da 100 ml;
- Pipetta graduata da 10 ml con propipetta;
- Bacchettina di vetro;
- Piastra termica;
- Provette da batteriologia 16X160mm con tappo metallico;
- Piastre di Petri in plastica sterili;
- Autoclave;
- Cartina indicatore di pH;
Sostanze utilizzate:
- Terreno di coltura liofilizzato di Plate Count Agar (PCA) o simile;
- Acqua distillata;
- NaOH 0,1M;
- HCl 0,1M.
Valutazione dei rischi:
L’esperienza deve essere realizzata in presenza di personale docente qualificato. Usare i dispositivi di protezione individuale come il camice, occhialetti para schizzi, guanti termici, mascherine e lavorare sotto cappa aspirante. Attenzione alle fiamme libere del becco bunsen e alle possibili scottature. Seguire le norme di sicurezza disponibili nel laboratorio.
Procedimento:
- Pesare e sospendere il quantitativo necessario sapendo che la concentrazione di terreno PCA è di 22.5 g/l e versare in un volume di acqua distillata necessario. Ad esempio, nel nostro caso 2,25 g in 100 ml di acqua. L’acqua deve essere a temperatura ambiente;
- Riscaldare e sciogliere la sospensione fino all’ebollizione mescolando continuamente, con una bacchettina di vetro, per garantire la completa dissoluzione del terreno. Continuare a bollire fino a quando tutti i componenti non si saranno sciolti. Attenzione alla possibile fuoriuscita del terreno dalla beuta se la temperatura della piastra termica è troppo elevata;
- Misurare il pH con una cartina indicatore universale e controllare che esso sia a pH 7,0 altrimenti aggiustarlo aggiungendo alcune gocce di NaOH 0,1 M o di HCl 0,1 M;
- Distribuire circa 10-12 ml di terreno, utilizzando una pipetta graduata da 10 ml, in ogni provetta da batteriologia 16X160mm e tapparle con tappo metallico;
- Autoclavare e sterilizzare il PCA collocando il terreno in un’autoclave e sottoporlo ad una pressione di 1 Atm a 121°C per 15-20 minuti. La sterilizzazione in autoclave elimina eventuali potenziali contaminanti e garantisce la crescita solo delle specie batteriche presenti nel materiale da noi in seguito seminato e in studio;
- Raffreddare dopo la sterilizzazione in autoclave e lasciare raffreddare il terreno PCA fino a una temperatura non inferiore ai 50-55°C, assicurando che il terreno sia ancora allo stato liquido e possa essere facilmente versato nelle provette. Sotto tale intervallo il terreno diventa solido;
- Mescolare e Versare il terreno in piastre Petri sterili, assicurandosi di coprire uniformemente il fondo delle piastre. Agitare delicatamente il contenitore per ottenere uniformità. Questa operazione deve essere effettuata in asepsi sotto cappa sterile a flusso laminare o, in mancanza di questa, in prossimità di un becco bunsen acceso;
- Conservare il terreno chiuso nelle piastre di Petri, impacchettate con carta stagnola, in frigorifero per poterle usare successivamente.
Per avere una più chiara esecuzione tecnica per la preparazione di un terreno di coltura di seguito vi sono dei video esplicativi:
Osservazioni:
Nell’eseguire i vari passaggi dopo la sterilizzazione del terreno di coltura, lavorare in asepsi per impedire ad eventuali inquinanti (batteri presenti nell’ambiente), di contaminare il terreno di coltura stesso.
L’aggiunta di agar rende il terreno semi solido, ma se nella composizione non è presente, il terreno di coltura sarà liquido a temperatura ambiente e non potrà essere messo in piastra.
Si può evitare di versare il PCA in piastra e metterlo ad esempio a becco di clarino, semplicemente inclinando la provetta e lasciarlo solidificare in questo modo; si potrà avere una superficie di semina maggiore e la possibilità di fare degli inoculi per infissione… ma questo sarà argomento di un altro articolo.
Per gentile concessione, foto e video realizzati dall’Ass. Tecn. Celeste Alfinito.
